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.2013年11月28日；4（11）：e936。
doi:10.1038/cddis.2013.457。

DR5作为Smac诱导凋亡的关键NF-κB调节介质的鉴定

I埃克哈特 1, S Roesler公司, S富尔达
附属公司

DR5作为Smac诱导细胞凋亡的关键、NF-κB调节介质的鉴定

I埃克哈特等。 细胞死亡疾病. .

摘要

Smac模拟物通过中和凋亡抑制蛋白（IAP）促进凋亡，被认为是一种有前景的癌症治疗药物。尽管自分泌/旁分泌肿瘤坏死因子-α（TNFα）环与Smac模拟物诱导的细胞死亡有关，但关于决定Smac模仿物敏感性的其他因素尚不清楚。通过全基因组基因表达分析，我们确定死亡受体5（DR5）是Smac模拟物诱导凋亡的新的关键介体。虽然一些对Smac模拟物BV6敏感的细胞株以TNFα依赖的方式死亡，但A172胶质母细胞瘤细胞在很大程度上独立于TNFα/TNFR1进行BV6诱导的凋亡，因为TNFα阻断抗体Enbrel或TNFR1敲除提供的保护很少。然而，BV6刺激的核因子κB（NF-κB）激活对细胞凋亡至关重要，因为显性负性IκBα超阻遏物（IκB-α-SR）的过度表达抑制了NFκB，从而阻断了BV6诱导的细胞凋亡。在IκBα-SR过表达细胞与载体控制细胞中进行的无偏全基因组基因表达研究表明，BV6以NF-κB依赖的方式增加DR5的表达。重要的是，这种BV6刺激的DR5上调对细胞凋亡至关重要，因为DR5的短暂或稳定敲低显著抑制了BV6触发的细胞凋亡。此外，DR5沉默可减弱RIP1/FADD/caspase-8细胞溶质细胞死亡复合物的形成以及caspase-8,-3和-9的激活。通过将DR5确定为Smac模拟物诱导凋亡的关键介质，我们的研究结果为控制癌细胞对Smac模仿物敏感性的决定因素提供了新的见解。

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数字

图1
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BV6介导的A172细胞凋亡主要是TNFα-独立。(一和b条)细胞处理72 h，在有或无20个BV6指示浓度的情况下 μM zVAD.fmk或10 μg/ml安布雷。细胞存活率通过MTT或结晶紫法测量，并表示为未经处理的对照组的百分比(一). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡(b条). 平均值±S。显示了重复进行的三个独立实验的D。(c（c）——e（电子）)用抗肿瘤坏死因子受体1或对照siRNA的siRNA瞬时转染细胞，并处理72 h，指示浓度为BV6。通过蛋白质印迹分析TNFR1的蛋白质表达，GAPDH作为负载对照(c（c）). 用MTT法测定细胞活力，并用未经处理的对照组的百分比表示(d日). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡，并显示特异性细胞凋亡的百分比(e（电子）). 平均值±S。显示了重复进行的三到四个独立实验的E.M
图1
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BV6介导的A172细胞凋亡主要是TNFα-独立。(一和b条)细胞处理72 h，在有或无20个BV6指示浓度的情况下 μM zVAD.fmk或10 μg/ml安布雷。细胞存活率通过MTT或结晶紫法测量，并表示为未经处理的对照组的百分比(一). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡(b条). 平均值±S。图中显示了重复进行的三个独立实验的D。(c（c）——e（电子）)用抗肿瘤坏死因子受体1或对照siRNA的siRNA瞬时转染细胞，并处理72 h，指示浓度为BV6。通过western blotting分析TNFR1的蛋白表达，GAPDH作为负荷控制(c（c）). 用MTT法测定细胞活力，并用未经处理的对照组的百分比表示(d日). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡，并显示特异性细胞凋亡的百分比(e（电子）). 平均值±S。显示了重复进行的三到四个独立实验的E.M
图2
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BV6触发IAP蛋白耗竭和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活。(一)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。通过western blotting分析cIAP1和XIAP的表达水平。GAPDH的表达作为负荷控制。(b条)A172细胞用5 μM BV6见证20 μM zVAD.fmk公司。使用抗Caspase-8抗体免疫沉淀Caspase-8，并通过western blotting检测指示蛋白。(c（c）)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）；星号表示非特异性带。通过western blotting分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活，箭头指示活性裂解片段。的表达式β-肌动蛋白和GAPDH作为负荷控制
图3
图3
BV6激活规范和非规范NF-κB通路。(一)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）；用10刺激 纳克/毫升TNFα用作原型规范NF-κB刺激。NIK、p100、p52、p65和I的表达和/或磷酸化κB类αwestern印迹分析。GAPDH的表达作为负荷控制。(b条)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。通过western blotting分析细胞核或胞浆中p50、p52、p65和RelB的表达水平。α-微管蛋白用于细胞质组分的纯度控制，层粘连蛋白B1用于核组分和β-肌动蛋白作为两种组分的负荷控制。(c（c）)A172和MDA-MB-231细胞处理24小时 h带5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。NF公司-κ使用FITC-标记的NF测定B转录活性-κB报告构造。NF增加倍数-κB转录活性以平均值±S表示。D.至少进行三次独立实验。(d日)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。TNF的mRNA表达水平αRT-qPCR分析p100和RelB。RNA水平的倍增显示为两到五个独立实验的平均值+S.E.M.（一式三次）
图3
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BV6激活规范和非规范NF-κB通路。(一)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）；用10刺激 纳克/毫升TNFα用作原型规范NF-κB刺激。NIK、p100、p52、p65和I的表达和/或磷酸化κB类αwestern印迹分析。GAPDH的表达作为负荷控制。(b条)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。通过western blotting分析细胞核或胞浆中p50、p52、p65和RelB的表达水平。α-微管蛋白用于细胞质组分的纯度控制，层粘连蛋白B1用于核组分和β-肌动蛋白作为两种组分的负荷控制。(c（c）)A172和MDA-MB-231细胞处理24小时 h带5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。NF公司-κ使用FITC-标记的NF测定B转录活性-κB报告构造。NF增加倍数-κB转录活性以平均值±S表示。D.至少进行三次独立实验。(d日)A172和MDA-MB-231细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。肿瘤坏死因子mRNA表达水平αRT-qPCR分析p100和RelB。RNA水平的倍增显示为两到五个独立实验的平均值+S.E.M.（一式三次）
图4
图4
NF公司-κB是BV6诱导的细胞死亡所必需的。(一)用I转导A172和MDA-MB-231细胞κB类α-SR或矢量控制。I的表达式κB类α和我κB类α-免疫印迹法分析SR。GAPDH表达用作加载控制。(b条)用I转导A172和MDA-MB-231细胞κB类α-SR或矢量控制。用5次 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。cIAP1、p100、p52、RelB和I的表达和/或磷酸化κB类αwestern印迹分析。GAPDH的表达作为负荷控制。(c（c）和d日)稳定表达I的A172和MDA-MB-231细胞κB类α-SR或病媒控制治疗72 h，指示浓度为BV6。细胞存活率通过MTT或结晶紫法测量，并表示为未经处理的对照组的百分比(c（c）). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡(d日). 平均值±S。图中显示了重复进行的三到七个独立实验。(e（电子）)稳定表达I的A172细胞κB类α-SR或病媒控制治疗指定时间5 μM BV6公司。用western blotting分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活，箭头表示活性裂解片段；β-肌动蛋白起负荷控制作用；星号表示不特定的带。(（f）)A172细胞治疗24小时 h带5 μM BV6见证20 μM zVAD.fmk公司。使用抗Caspase-8抗体免疫沉淀Caspase-8，并通过western blotting检测指示蛋白
图4
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NF公司-κBV6诱导的细胞死亡需要B。(一)用I转导A172和MDA-MB-231细胞κB类α-SR或矢量控制。I的表达式κB类α和我κB类α-免疫印迹法分析SR。GAPDH表达作为负载对照。(b条)用I转导A172和MDA-MB-231细胞κB类α-SR或矢量控制。细胞用5 μM BV6（A172）或50 nM BV6（MDA-MB-231）。cIAP1、p100、p52、RelB和I的表达和/或磷酸化κB类αwestern印迹分析。GAPDH的表达作为负荷控制。(c（c）和d日)稳定表达I的A172和MDA-MB-231细胞κB类α-SR或病媒控制治疗72 h，指示浓度为BV6。细胞存活率通过MTT或结晶紫法测量，并表示为未经处理的对照组的百分比(c（c）). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡(d日). 平均值±S。图中显示了重复进行的三到七个独立实验。(e（电子）)稳定表达I的A172细胞κB类α-SR或病媒控制治疗指定时间5 μM BV6公司。用western blotting分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活，箭头表示活性裂解片段；β-肌动蛋白起负荷控制作用；星号表示不特定的带。(（f）)A172细胞治疗24小时 h带5 μM BV6见证20 μM zVAD.fmk公司。使用抗Caspase-8抗体免疫沉淀Caspase-8，并通过western blotting检测指示蛋白
图5
图5
BV6通过NF刺激DR5的上调-κB(一和b条)A172细胞用5 μM BV6公司。通过RT-qPCR分析DR5 mRNA水平，显示DR5 mRNA水平增加了一倍(一). 平均值±S。显示了三个独立实验的E.M.值。western blotting分析DR5蛋白表达；β-肌动蛋白作为负载控制(b条). (c（c）和d日)稳定表达I的A172细胞κB类α-SR或病媒控制治疗指定时间5 μM BV6。通过RT-qPCR分析DR5 mRNA水平，显示DR5 mRNA水平增加了一倍(c（c）). 平均值±S。给出了五个独立实验的D值。通过蛋白质印迹分析DR5蛋白的表达；β-肌动蛋白作为负荷控制(d日)
图6
图6
DR5上调对BV6介导的细胞死亡是必要的。A172细胞瞬时转染5 nM siRNA靶向DR5或对照siRNA并治疗6 h（RT-qPCR）或24 h（western blotting）与5 μM BV6公司。通过western blotting分析DR5的蛋白表达，GAPDH作为负荷控制(一). 通过RT-qPCR分析DR5 mRNA水平，显示DR5 mRNA水平增加了一倍(b条). 平均值±S。给出了两个独立实验的D值。用MTT法测定细胞活力，并用未经处理的对照组的百分比表示(c（c）). 使用流式细胞术通过PI染色细胞核的DNA片段测定细胞凋亡，并显示特异性细胞凋亡的百分比(d日). 平均值±S。图中显示了重复进行的三到四个独立实验。用western blotting分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活，箭头显示活性裂解片段；β-肌动蛋白起负荷控制作用；星号表示非特定带(e（电子）). 使用抗Caspase-8抗体免疫沉淀Caspase-8，并通过western blotting检测指示蛋白(（f）)
图7
图7
BV6诱导的信号通路方案。BV6触发NF-κB激活和诱导靶基因，如肿瘤坏死因子α或DR5（数字参考5）.NF型-κB介导BV6诱导TNF细胞凋亡α-通过自分泌/旁分泌TNF的依赖方式α/TNFR1环路，或者可替换地，以依赖于DR5的方式。BV6刺激，NF-κDR5的B依赖性上调是形成由caspase-8、RIP1和FADD组成的细胞溶质复合体，随后caspase激活和凋亡所必需的
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