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.2013年12月；4(12):2439-50.
doi:10.18632/noctarget.1535。

锌（II）螯合剂抑制p53介导的细胞凋亡的评价

盛田昭夫 1, 新谷阿里亚苏, 大亚松一郎, 伊佩·高桥, 王兵（Bing Wang）, 田中高茹, 内田隆彦（Takatoshi Uchida）, 冈崎裕久, Kengo Hanaya先生, Atsushi Enomoto公司, Mitsuru Nenoi公司, 池田正彦, 新青木, 河内义雄
附属公司

锌（II）螯合剂抑制p53介导的细胞凋亡的评价

盛田昭夫等。 Oncotarget公司. 2013年12月.

摘要

在之前的一项研究中，我们报道了原钒酸钠（vanadate）是第一种已知的抑制剂，它能够通过阻断转录依赖性和转录非依赖性p53凋亡途径来保护小鼠免受辐射诱导的胃肠道综合征的死亡。在本文中，我们报告了钒酸盐相对于其他已知的辐射保护性p53抑制剂，即吡氟菊酯-α（PFTα）和吡氟菊酯-µ（PFTµ），具有独特的诱导p53变性的活性。钒酸盐的这种强大的辐射防护作用促使我们对能够诱导p53变性的p53抑制剂进行更广泛的研究。基于锌离子作为p53的结构因子可以诱导p53变性的事实，我们筛选了一些锌（II）螯合剂，用于抑制体外p53的DNA结合活性和抑制MOLT-4细胞中辐射诱导的p53依赖性凋亡。研究结果表明，五种锌（II）螯合剂中有两种也抑制了细胞凋亡。在所测试的抑制剂中，Bispicen（N，N’-双（2-吡啶甲基）-1,2-乙二胺）具有最高的抑制活性。使用具有不同p53状态或功能的细胞（即p53敲除MOLT-4转化子及其回复子、p53突变细胞、p53完整细胞）和p53诱导的依赖性凋亡刺激进行的机制研究表明，Bispicen对凋亡的抑制作用是通过p53特异性介导的。此外，Bispicen与钒酸盐类似，可诱导p53变性，并阻断转录依赖性和非依赖性凋亡途径。我们的研究结果表明，锌（II）螯合剂的使用是一种通过抑制p53依赖性凋亡途径防止辐射诱导的p53依赖型凋亡的新方法。

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数字

图1
图1。在三种受试的放射防护型p53抑制剂中，钒酸盐仅诱导p53变性
使用抗p53 PAb 240 mAb（上图）和DO-1 mAb（下图）的p53免疫沉淀（IP）。PAb 240 mAb在用800µM钒酸盐（V）处理的10 Gy辐照MOLT-4细胞中识别p53，但在单独暴露于γ射线（IR后6小时）的细胞或用IR加50µM PFTα（α）或7.5µM PFTµ（µ）处理的细胞中不识别p53。分别使用未照射（第一道）或10Gy-照射（第二道）MOLT-4细胞培养6h的全细胞裂解物（WCL）作为p53的阴性和阳性对照。使用抗p53 DO-1单克隆抗体通过免疫印迹法观察WCL中的p53（通道1和2）和免疫沉淀p53（路径3至7）
图2
图2。锌（II）螯合剂及其与锌的结合常数2+
结构式、配位数和与锌的结合常数（对数K（K）秒（ZnL））。上部面板显示由两个化合物组成的高亲和力基团，每个化合物的结合常数大于1015下面板显示由三个化合物组成的低亲和力基团，每个化合物的结合常数小于1015.
图3
图3。不同浓度锌（II）螯合剂对重组FLAG-p53 DNA结合活性的电泳迁移率变化分析（EMSA）
在37˚C的温度下，在有或无指定浓度螯合剂的情况下，将FLAG-p53预培养10分钟，并使用FITC-标记的寡核苷酸探针在37°C下进行3小时的DNA结合反应。然后在4°C下通过电泳分离反应混合物，并通过荧光强度测量量化条带。按照材料和方法所述，计算FLAG-p53与靶DNA的相对DNA结合率。
图4
图4。锌（II）螯合剂对p53依赖性辐射诱导的细胞死亡、∆ψm损失和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活的影响
A.锌（II）螯合剂对10Gy-辐射MOLT-4细胞死亡的剂量反应。通过染料隔离试验评估IR后18 h的细胞死亡率。B.锌（II）螯合剂对10Gy-辐照MOLT-4细胞中∆ψm损失的剂量反应。通过MitoTracker染色和流式细胞仪在IR后12 h测量细胞丢失∆ψm的百分比。A和B中显示的数据是3-5个独立实验的平均值±标准偏差（SD）。C.在10Gy照射的MOLT-4细胞中锌（II）螯合剂对胱天蛋白酶激活的剂量反应。IR后10h采集细胞，免疫印迹法检测蛋白质。
图5
图5。Bispicen抑制辐射诱导的MOLT-4凋亡对p53的需求
免疫印迹法检测p53和FLAG表位。β-actin作为内部对照。B.通过染料隔离试验（10 Gy-IR后18 h；左侧）和使用MitoTracker Red CMXRos染料的流式细胞术（10 Gy-IR后12 h；右侧）对凋亡细胞进行定量。所示数据为3-5个独立实验的平均值±SD。
图6
图6。Bispicen不能抑制p53依赖性凋亡
在加入依托泊苷后立即将A.B.Bispicen加入培养基中。添加足叶乙甙18小时后，通过染料隔离试验评估细胞死亡率。A.Bispicen对足叶乙甙诱导p53突变白血病细胞系、KU812、CCRF-CEM和Ball-1凋亡的影响。分别用1μM、50μM、2.5μM和1μM足叶乙甙处理MOLT-4、KU812、CCRF-CEM和Ball-1细胞。B.Bispicen对足叶乙甙诱导的p53完整细胞株HL60和U937凋亡的影响。分别用10µM和5µM处理HL60和U937细胞。C.Bispicen对MOLT-细胞p53依赖性凋亡的影响。在p53诱导的依赖性凋亡刺激后，立即将Bispicen添加到培养基中。刺激18小时后，通过染料隔离试验评估细胞死亡百分比。茴香霉素和C2陶瓷分别以0.5µg/ml和75µM的浓度使用。所示数据为3个独立实验的平均值±SD。
图7
图7。Bispicen以剂量依赖性方式诱导p53变性
A.如图1所示，使用抗p53 PAb 240 mAb（上面板）和DO-1 mAb进行免疫沉淀（IP）。对MOLT-4细胞进行10 Gy-照射，并用指示浓度的螯合剂或钒酸盐（Vana）处理，然后在IR后6 h收获。将照射细胞的IP样品装载量归一化为等量的DO-1-免疫沉淀p53。分别使用未照射（第一道）或10Gy-照射（第二道）MOLT-4细胞培养6h的全细胞裂解物（WCL）作为p53的阴性和阳性对照。使用抗p53 DO-1单克隆抗体通过免疫印迹法观察WCL中的p53（通道1和2）和免疫沉淀p53（路径3至11）。B.在没有和存在锌（II）螯合剂或钒酸盐（每个2µM）和锌的情况下，PBS缓冲液（pH 7.4）中重组FLAG-p53（20 nM）的CD光谱2+（20µM）。
图8
图8。锌（II）螯合剂对辐照MOLT-4细胞中p53靶基因反式激活和p53积累的影响
A.锌（II）螯合剂对p53积累和p53靶基因产物PUMA和p21诱导的剂量反应。10Gy IR后6h采集细胞，用免疫印迹法检测蛋白。B.转录的实时PCR分析彪马和第21页在辐照的MOLT-4细胞中缺少或存在指示浓度的锌（II）螯合剂。在10 Gy IR后6 h采集细胞。数据显示为3个独立实验的平均值±SD。
图9
图9。Bispicen干扰p53的线粒体易位
A.在10 Gy IR和处理后6 h分离组分，然后进行p53、线粒体标记物（Bcl-2、Bak和VDAC1）的免疫印迹分析，以β-actin作为细胞溶质标记物。组分1（F1）含有线粒体成分，组分2（F2）含有细胞溶质成分。B.Bcl-2和p53在辐照MOLT-4细胞中的免疫共沉淀（IP）（10 Gy-IR后6 h）。培养6h的未照射（第一道）或10Gy照射（第二道）MOLT-4细胞的WCL分别为p53的阴性和阳性对照。它们也被用作Bcl-2的阳性对照。
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参考文献

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