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.2013年11月21日；8（11）：e74502。
doi:10.1371/journal.pone.0074502。 2013年电子收集。

一种对maspin亚细胞定位和功能至关重要的内在决定簇的鉴定

Sijana H Dzinic公司 1, 亚历山大·卡普伦, 李晓华, 玛格丽达·贝尔纳多, 孟永红, 艾沃里·迪恩, 大卫·克拉斯, 保罗·斯特默, Namhee Shin（南希信）, 富尔维奥·罗纳尔多, 盛世杰
附属公司

对maspin亚细胞定位和功能至关重要的内在决定簇的识别

Sijana H Dzinic公司等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

Maspin是一种多方面的肿瘤抑制因子，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，但仅抑制组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）等丝氨酸蛋白酶样酶。Maspin在上皮细胞中特异表达，并在肿瘤进展过程中受到不同的调节。一项新的共识表明，maspin亚细胞定位从细胞核向细胞质分层的转变会导致癌症预后不良。在当前的研究中，我们采用了一种合理的诱变方法，并表明maspin反应中心环（RCL）及其邻近序列对maspin的稳定性至关重要。此外，当在多个肿瘤细胞系中表达时，天冬氨酸（346）（D（346。细胞分级、免疫和蛋白质组学鉴定的证据，结合内源性蛋白质的荧光成像、荧光蛋白融合构建体以及双分子荧光互补（BiFC）的证据表明，maspin（D346E）的核富集增加，至少部分是因为它与HDAC1的亲和力增加。Maspin（D346E）作为HDAC抑制剂也比Maspin（WT）更有效。综上所述，我们的证据表明D（346）是maspin序列中的一个关键顺式元素，它决定maspin的分子背景和亚细胞定位。从我们的证据中衍生出的一个机制模型为开发基于maspin的生物活性HDAC抑制剂用于癌症治疗提供了新的机会。

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数字

图1
图1。理性maspin突变体的构建和表达。
(A类)UCSF Chimera生成的人体maspin的带状表示(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera网站/). 反应中心回路（RCL）p′站点R的相对位置340和相邻的D346残渣被描述为球棒模型。(B类)野生型人类maspin和四个理性maspin突变体的示意图。RCL和D的相对位置346在主maspin序列中进行了描述。全长的野生型maspin被称为maspin重量，截断突变体是maspin1–323（RCL上游16个氨基酸的C-末端缺失），maspin1–340（R后删除C端子340)和梅斯平1–348（L后删除C端348)点突变是maspinD346E（东风）(C类)梅斯平蛋白的蛋白印迹重量腺病毒载体（多重感染，MOI = 30）在蛋白酶体抑制剂MG132存在或不存在的情况下（5µM，6小时处理）。以腺病毒空载体（EV）感染DU145细胞作为阴性对照。PARP用于监测感染和MG132治疗后的细胞活力。GAPDH被用作负荷控制。(D类)感染后三天DU145细胞中重组maspin的Western blot与CRL2221细胞表达内源性maspin相关。β微管蛋白作为负荷对照。(E类)表达maspin的感染DU145细胞的生长曲线重量（•），maspin第346e页(○) 或空矢量控制(▪).
图2
图2。maspin的亚细胞定位重量和梅斯平D346E（东风）.
(A类)感染后DU145细胞中maspin（绿色）和核膜标记层粘连蛋白B（红色）的共焦免疫荧光成像。(B类)腺病毒载体（MOI）感染后3天H1299细胞中重组maspin的Western blot = 20). GAPDH被用作负荷控制。(C类)腺病毒感染后H1299中重组maspin的共焦免疫荧光成像。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺 = 20微米。(D类)受感染H1299细胞的分离裂解物中maspin、组蛋白3、Hsp90、HDAC1和GAPDH的蛋白质印迹。确定maspin的亚细胞差异分布D346E（东风）和梅斯平重量，表达重组maspin的H1299细胞重量或梅斯平D346E（东风）被分离。如所示图2DHDAC1、组蛋白3和Hsp90加GAPDH的western blotting分别证明了核可溶、核染色质结合和细胞溶质部分的纯度。两个maspin重量和梅斯平D346E（东风）存在于细胞溶质室中。然而，更高级别的maspinD346E（东风），与maspin相比重量在核可溶部分中检测到。此外，两个核maspin重量和核maspinD346E（东风）在染色质结合组分中检测到。
图3
图3。maspin显性核定位D346E（东风）在将maspin自然分布到细胞质和细胞核的细胞中。
(A类)pEGFP N1-masin瞬时转染48小时后活PC3细胞的免疫荧光成像重量和pEGFP N1-maspinD346E（东风）→ 表示胞质maspin，而▸ 表示核maspin。pEGFP作为对照。比例尺 = 20微米。
图4
图4。maspin的核定位重量但不是马斯平D346E（东风）被核出口抑制剂Leptomycin B（LMB）抑制。
(A类)pEGFP N1-masin瞬时转染40小时后活H1299细胞的免疫荧光成像（x40）重量和pEGFP N1-maspinD346E（东风）. → 表示胞质maspin，而▸ 表示核maspin。pEGFP N1和用作对照。(B类)pEGFP N1-masinWT和pEGFP-N1-masin瞬时转染后44小时活H1299细胞的免疫荧光成像D346E（东风）在LMB存在下（2.5 ng/mL，4小时）。→ 表示胞质maspin，而▸ 表示核maspin。GFP单独表达或HDAC1-RFP作为对照(A类)和(B类). 比例尺 = 20微米。
图5
图5。Maspin亚细胞定位不涉及内质网滞留。
(A类)CRL2221、MCF10A和BEAS2B细胞内源性maspin（绿色）和GRP78（红色）的共焦免疫荧光成像。用DAPI对细胞核进行复染。(B类)DU145细胞中重组maspin（绿色）和内源性GRP78（红色）的共聚焦免疫荧光成像。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺 = 20微米。
图6
图6。maspin核定位增强D346E（东风）与HDAC1相互作用增加相关。
(A类)MCF10A细胞内源性maspin（绿色）和HDAC1（红色）免疫荧光染色的共焦成像。比例尺 = 20微米(B类). 与pBiFC maspin瞬时横断的活PC3和DU145细胞的双分子荧光互补（BIFC）重量YC或pBiFC maspinD346E（东风）YC与pBiFC HDAC1 YN联合使用。在PC3细胞中，分别使用bJunYN和BiFC的BiFC bFsYC以及bJunYN和BiFC的BiFC bFsYCΔ179–193作为阳性和阴性对照。比例尺 = 10微米(C类)与pEGFP N1-masin联合转染后活PC3细胞的免疫荧光成像（x40）重量或pEGFP N1 maspinD346E（东风）结合pcDNA3.1 HDAC1-RFP。→ 表示胞质maspin/HDAC1相互作用和▸ 表示核maspin/HDAC1相互作用。比例尺 = 20微米。(D类)在DU145细胞中用maspin抗体免疫沉淀（IP）后对重组maspin和HDAC1进行Western blot。小鼠IgG用作阴性对照。maspin、HDAC1和加载控制GAPDH的总电平显示在输入面板中。下面的数字表示标准化的HDAC1/maspin比率。
图7
图7。Maspin核定位与组蛋白乙酰化增加和HDAC再表达基因的释放相关。
(A类)重组maspin、HDAC1和HDAC1靶蛋白（赖氨酸9乙酰化组蛋白3（H3-乙酰K9))在DU145电池中。GAPDH被用作负荷控制。(B类)maspin差异调节的HDAC1靶基因的Q-RT-PCR。通过qRT-PCR获得的阈值循环（ct）数由内部GAPDH控制标准化，并表示为折叠变化。乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂重量：黑色条；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂D346E（东风）：白色条。
图8
图8。解释maspin在肿瘤进展中失调的假设模型。
(A类)良性肿瘤或预后较好的分化较好的癌症与核maspin相关。与假设的HDAC1相关核因子X相比，核maspin对HDAC1的亲和力更强(B类)高级别癌表现出分化程度较低的表型，预后较差，与胞质maspin或maspin丢失有关。在癌症中，假设HDAC1相关核因子X是X′，与maspin相比，它对HDAC1的亲和力更强。(C类)生物工程maspin突变体或其衍生物在治疗晚期疾病中的治疗潜力。Maspin突变体在晚期疾病中恢复Maspin核定位和HDAC1抑制。
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参考文献

    1. Sheng SJ，Truong B，Fredrickson D，Wu RL，Pardee AB等人（1998）组织型纤溶酶原激活剂是肿瘤抑制基因maspin的靶点。美国国家科学院院刊95:499-504。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Yoshida M、Furumai R、Nishiyama M、Komatsu Y、Nishino N等（2001）组蛋白脱乙酰酶作为癌症化疗的新靶点。癌症化疗与药理学48:S20–S26。-公共医学
    1. Pemberton PA，Wong DT，Gibson HL，Kiefer MC，Fitzpatrick PA，et al.（1995）肿瘤抑制剂Maspin不经历应激-松弛转换或抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶-Maspin不是蛋白酶抑制剂Serpin的证据。生物化学杂志270:15832–15837。-公共医学
    1. Al-Ayyoubi M，Gettins PGW，Volz K（2004）人类maspin的晶体结构，一种具有抗肿瘤特性的蛇蛋白-maspin反应中心环暴露但受限。生物化学杂志279:55540–55544。-公共医学
    1. Silverman GA、Bird PI、Carrell RW、Church FC、Coughlin PB等（2001）蛇蛋白是结构相似但功能多样的蛋白质的一个不断扩大的超家族——进化、抑制机制、新功能和修订的命名法。生物化学杂志276:33293–33296。-公共医学

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