Dephosphorylation of barrier-to-autointegration factor by protein phosphatase 4 and its role in cell mitosis

doi:10.1074/jbc.M113.492777

.2014年1月10日；289(2):1119-27.

doi:10.1074/jbc。M113.492777。 Epub 2013年11月21日。

蛋白磷酸酶4对屏障自整合因子的去磷酸化及其在细胞有丝分裂中的作用

庄晓雷¹, 埃琳娜·塞梅诺娃, 德拉甘·马里克, 罗伯特·克雷吉

附属机构

采购管理信息： 24265311
PMCID公司：项目经理3887179
内政部： 10.1074/jbc。13492777南非兰特

蛋白磷酸酶4对屏障自整合因子的去磷酸化及其在细胞有丝分裂中的作用

庄晓雷等。生物化学杂志. 2014.

.2014年1月10日；289(2):1119-27.

doi:10.1074/jbc。M113.492777。 Epub 2013年11月21日。

作者

庄晓雷¹, 埃琳娜·塞门诺娃, 德拉甘·马里克, 罗伯特·克雷吉

附属

¹来自NIDDK分子生物学实验室。

采购管理信息： 24265311
PMCID公司：项目经理3887179
内政部： 10.1074/jbc。M113.492777号

摘要

屏障-自整合因子（BAF或BANF1）在多细胞真核生物中高度保守，并因其在逆转录病毒DNA整合中的作用而首次被鉴定。纯合子BAF突变体是致命的，BAF的缺失会导致有丝分裂和随后的核膜组装期间的染色质分离缺陷。BAF以磷酸化和非磷酸化形式存在，磷酸化位点Thr-2、Thr-3和Ser-4位于N末端附近。疫苗相关激酶1是负责BAF磷酸化的主要激酶。我们已确定负责Ser-4去磷酸化的主磷酸酶为蛋白磷酸酶4催化亚单位。通过检测磷酸化BAF（pBAF）和总BAF（tBAF）在细胞周期中的细胞分布，我们发现pBAF与末期染色体的核心区有关。BAF的耗尽或其磷酸化状态的扰动不仅会导致核膜缺陷，包括LEM结构域蛋白的错误定位和核内部的广泛内陷，而且还会损害细胞周期的进展。这种表型与BAF点突变导致的进行性综合征患者细胞中的表型惊人相似。

关键词：BAF；BAF带1；BAF带1 PP4C；细胞周期；染色体；有丝分裂；核膜；磷酸化。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**pBAF被PP4C络合物脱磷。** A类，pBAF抗体的特异性。*左侧面板*，用BAF siRNA或VRK1 siRNA转染HEK293细胞，并在4-12%SDS-PAGE凝胶上分离所得裂解产物。将凝胶转移到PDVF膜上，并用pBAF抗体、tBAF抗体或VRK1抗体进行印迹。*右侧面板*，空载体，BAF-WT，BAF-S4D或BAF-S4A在HEK293细胞中过表达。用GFP抗体对所得裂解产物进行免疫沉淀，并用pBAF或tBAF抗体进行免疫印迹。B类，将整个HEK293细胞裂解物与指示的磷酸酶抑制剂的增加量在30°C下孵育0.5 h。然后用pBAF抗体对裂解物进行免疫印迹，以检查磷酸酶抑制剂对提取物中存在的内源性磷酸酶的pBAF脱磷酸作用的影响，以tBAF抗体为对照。*车道1*显示了未经孵育的裂解物对照。C类，用PP2A siRNA池或PP4C siRNA池转染HEK293细胞。用所示抗体对所得细胞裂解物进行印迹。D类将单个PP4C siRNA 6、7和8转染到HEK293细胞中，并通过免疫印迹法评估其对BAF磷酸化的影响。E类用PP4C抗体和IgG（作为对照）对整个HEK293细胞裂解液进行免疫去除。用Western blot检测PP4C残留水平。F类，将免疫缺失的细胞裂解液在30°C下孵育0.5 h，并使用用IgG耗尽的细胞裂解物作为对照。免疫印迹法检测pBAF和tBAF。*G公司*将PP4C野生型及其非活性突变体PP4C-H56Q和PP4C-R85A分别转染HEK293细胞，用FLAG珠免疫纯化，用3×FLAG肽洗脱。洗脱的PP4C或突变体与pBAF孵育30分钟，并用PP4C和pBAF抗体进行免疫印迹。*H（H）*和我，用单个R1 siRNA 6、7和8转染HEK 293细胞(*H（H）*)或R2 siRNA 6、7和8(我). 用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

**图2。**
**通过细胞有丝分裂定位pBAF和tBAF。** A类用pBAF和tBAF抗体对间期HEK293细胞进行免疫染色。DAPI染色细胞核。B类，早期末期染色体核心区和非核心区的示意图。核心区域如所示红色，并且非核心区域被着色*绿色。C类*用pBAF抗体和DAPI（DNA）对晚期HEK293细胞进行固定和染色。箭头指示核心区域的信号。D类HEK293细胞有丝分裂时用tBAF和DAPI染色。箭头指示非核心区域的信号。用共焦显微镜拍摄图像。

**图3。**
**磷酸化对pBAF和tBAF在末期定位的影响。** A类和B类，用pBAF对用VRK1、PP4C或R2 siRNA转染的HEK293细胞进行免疫染色(A类)或tBAF(B类)抗体和DAPI。C类，pBAF在核心区域的荧光强度(B类)测量并绘制图表。将荧光强度归一化为对照组的信号（测量了20个以上的独立细胞），并通过t吨测试（*，第页< 0.05与控制）。D类，通过共聚焦显微镜观察在早期末期过表达磷酸模拟突变体的细胞中的GFP信号。

**图4。**
**BAF磷酸化影响emerin和NE形成的核心定位。** A类和B类将转染VRK1 siRNA或PP4C siRNA的HEK293细胞固定，并与pBAF抗体、emerin抗体和DAPI共同染色。拍摄末期早期的细胞(A类). 测量了pBAF和emerin在核心区域的荧光强度，并将其归一化为%对照(B类)（测量了20个以上的独立细胞；*，第页< 0.05与控制）。C类和D类，将转染有所示siRNA的HEK293细胞固定，并用层粘连蛋白B1抗体和DAPI染色(C类). NE内陷表示为箭头绘制NE内陷细胞的百分比(D类).E类和F类将转染BAF-S4D、BAF-S4A或BAF-WT-GFP融合蛋白的HEK293细胞固定，并用层粘连B1抗体和DAPI染色(E类).箭头指示转染细胞，以及箭头表示未感染细胞。绘制NE内陷细胞的百分比(F类).

**图5。**
**BAF磷酸化扰乱正常细胞周期进程。** A类，同步化不同细胞周期阶段的HeLa细胞（M，G₁、S和G₂阶段）用所示抗体进行免疫印迹分析。细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白E分别在M期和S期达到峰值，用免疫印迹法确认细胞周期分期。B类和C类用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷标记转染所示siRNA的HEK293细胞，并用PI染色。G中细胞的百分比₀/G公司₁、S和G₂/流式细胞术分析M期(B类). 利用PI染色强度的附加阈值，S期细胞进一步分化为早期、中期和晚期(C类). 数值表示为三次测量总人口的百分比。重复了两个单独的实验。D类对转染BAF WT或指示BAF突变构建物的HEK293细胞进行PI染色，并用流式细胞仪分析细胞周期。数值表示为两个单独实验中三次测量的总细胞数百分比。E类用双胸苷块同步表达过表达BAF WT的HeLa细胞或指示的BAF突变体，并释放8 h。细胞经PI染色并进行流式细胞术分析。结果表示来自三份样本的总人口百分比。

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