The Fusarium graminearum histone H3 K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters

doi:10.1371/journal.pgen.1003916

.2013年10月；9（10）：e1003916。

doi:10.1371/journal.pgen.1003916。 Epub 2013年10月31日。

禾谷镰刀菌组蛋白H3 K27甲基转移酶KMT6调节次级代谢产物基因簇的发育和表达

拉内尔·康诺利¹, 克里斯蒂娜·史密斯, 迈克尔·弗雷塔格

附属公司

PMID： 24204317
预防性维修识别码：项目经理3814326
内政部： 10.1371/日记本第103916代

禾谷镰刀菌组蛋白H3 K27甲基转移酶KMT6调节次级代谢产物基因簇的发育和表达

拉内尔·康诺利等。公共科学图书馆-基因. 2013年10月.

.2013年10月；9（10）：e1003916。

doi:10.1371/journal.pgen.1003916。 Epub 2013年10月31日。

作者

拉内尔·康诺利¹, 克里斯蒂娜·史密斯, 迈克尔·弗雷塔格

附属

¹美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学基因组研究和生物计算中心生物化学和生物物理系。

PMID： 24204317
预防性维修识别码：项目经理3814326
内政部： 10.1371/journal.pgen.1003916

摘要

谷物病原体禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）产生对人类和动物有毒的次级代谢产物，但基因簇的协同转录调控在很大程度上仍是一个谜。通过染色质免疫沉淀和高通量DNA测序（ChIP-seq），我们发现具有次级代谢产物簇的区域富含三甲基化组蛋白H3赖氨酸27（H3K27me3），这是一种与基因沉默相关的组蛋白修饰。H3K27me3主要发现于与其他镰刀菌物种缺乏同工酶的地区，通常是亚砾岩地区。二甲基或三甲基化H3K4（H3K4me2/3），两种与基因活性相关的修饰，以及H3K27me3主要存在于基因组的互斥区域。为了寻找H3K27me3的功能，我们删除了H3K27甲基转移酶KMT6的基因，KMT6是果蝇增强子E（z）的同源物。如western blot和ChIP-seq所示，kmt6突变体缺乏H3K27me3，表现出生长缺陷，不育，并组成性表达真菌毒素、色素和其他次级代谢产物的基因。转录组分析表明，4449个沉默基因中有75%富含H3K27me3。在WT中富集H3K27me3的基因子集在kmt6中获得H3K4me2/3。大量重叠的一组基因在kmt6中的表达增加。其余2720个注释沉默基因中，几乎95%的基因在kmt6中未表现出H3K27me3或H3K4me2/3的富集。在这些情况下，仅仅缺乏H3K27me3不足以表达，这表明需要额外的变化来激活基因。综上所述，我们发现H3K27me3的缺失允许额外14%的基因组表达，导致主要参与次级代谢途径和其他物种特定功能的基因的去表达，包括假定的分泌致病因子。本研究的结果为控制“隐秘基因组”，特别是次级代谢产物表达的新型靶向策略提供了框架。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。组蛋白标记区分镰刀菌属中的同步区和非同步区。**
同步映射生成于http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/Chromomap.html对于*禾谷镰刀菌*PH-1型(*Fg公司*),*F.垂直二极管*7600 (*Fv公司*)、和*尖孢F.oxysporum*4287 (*法罗群岛*).Fg公司超级染色体在顶部显示为交替的灰色阴影（参考染色体）。之间的同步区域*Fg公司*和每个染色体*Fv公司*和*法罗群岛*以不同颜色显示，其中特定颜色代表特定染色体；白色表示没有同步性。为了显示重组增加的区域，在*Fg公司*与参考菌株PH-1相比，菌株00-676显示为黑色阴影。显示H3K27me3（橙色）和H3K4me2（绿色）的ChIP-seq结果（读取/kb）。

**图2。这个*6公里*突变体缺少H3K27me3。**
A.从WT或*6公里*,*公里1*和*高功率放大器*突变体显示H3K27me3在*6公里*但水平不变*公里1*，一种缺乏Su（var）3-9、Clr4和DIM-5的H3K9甲基转移酶同源物的突变体*高性能操作*异染色质蛋白1（HP1）同源物被删除的突变体（L.R.Connolly和M.Freitag，正在准备中）。使用了两种不同的抗体（AM39535和ab6147）。B.H3K27三甲基化发生在大块中。H3K27me3（橙色）与H3K4me2（绿色）和-me3（蓝色）相互排斥，它们位于1号染色体的相同区域（第2至4章的图像见图S3）。H3K27me3的特定富集在*6公里*突变但在补充菌株中恢复(*6公里⁺*).

**图3。这个*6公里*突变体显示出生长和发育的改变。**
A.重量和*6公里*菌株生长在最小（MIN）或YPD培养基上。突变体在MIN上生长稀疏，在YPD上菌丝体致密、生长缓慢且呈深橙色。下部面板显示带有补充应变的YPD板(*6公里*+*6公里⁺*)和质粒控制(*6公里*+质粒）。B.重量和*6公里*在MIN或YPD上通过小试管进行生长，以测量25至33天的线性生长。结果是三次重复的平均值，条形图表示标准误差。C.在胡萝卜琼脂（CAR）平板上诱导性发育。WT板上的黑色斑块表明大量完全发育的鞘周，而在*6公里*盘子。补体菌株(*6公里*+*公里t6⁺*)能够以与WT相似的水平产生鞘外和子囊孢子。原生质体融合以补充*kmt6新⁺*WT菌株*马力⁺*细胞核不能恢复鞘周的形成。这些异核体没有分解，因为从CAR板的不同区域分离出了对G418和Hyg都有抗性的菌落，并在YPD+G418+Hyg（中心和边缘）上生长。

**图4。组蛋白修饰在全套*禾谷镰刀菌*基因。**
每个修改的左侧面板显示了所有基因的读取计数（读取/基因），这些基因被对齐以使已知或假定的转录起始位点（TSS）位置为“0”。中间的面板显示了所有基因的读取计数（读取数/基因数），这些基因按基因长度进行了标准化（x轴表示基因长度的百分比）。右侧面板显示每个基因的标准化读取计数（NLCS；密度）分布。对于大多数修改，观察到两个峰值，背景水平读取（“B”）和富集（“E”）。结果是低氮实验，但在高氮培养基上生长的样品获得了无法区分的结果。

**图5。组蛋白修饰的全局转录分析和相关性。**
A.生物复制高度相关。在所有四种条件下，生物复制品1的FPKM与每个基因的生物复制品2相比较，证明了复制实验之间的强相关性（r是相关系数）。B.每个基因的RPKM成对比较，WT与kmt6相比和低与。每个菌株的高氮含量显示了基因表达的全球变化。虽然基于氮的有效性，表达有一些变化，但在WT和*6公里*（橙色和绿色区域）。C.组蛋白修饰与表达状态相关。绘制每个基因的表达（RPKM）与。低氮条件下生长的WT对H3K27me3（橙色）、H3K4me2（绿色）、H4K4me3（灰色）和H3K36me3（黑色）的组蛋白富集（NLCS）。对于每个修改，除了H3K36me3，在y轴上可以看到两个点簇，与分布曲线中的背景和富集基因组相关（见图5）。D.低氮条件下与沉默和表达基因相关的组蛋白修饰。基因被分类为沉默（≤3 RPKM）或表达（>3 RPKM），H3K27me3、H3K4me2和H3K4me3的富集由EpiChIP NLCS值确定。绘制维恩图以显示WT（A–B）或*6公里*（C–D）。

**图6。初级（A）和次级（B）代谢中单个基因的热图（左侧面板）以及八个中心周围的基因簇（右侧面板）。**
很少有初级代谢基因受到*6公里*与大多数次级代谢基因相比，突变导致*6公里*。日志值₂RPKM的比率*公里t6*/每个菌株的WT或高/低氮条件都是彩色编码的，标尺如右图所示。例如，在（A）的左图中，红色代表对数₂(*6公里*/WT），共10个，表示*6公里*RPKM是WT RPKM的1024倍。簇2和簇5中的初级代谢基因在*6公里*表S2中列出了在高氮中下调的、和簇7及其假定功能。簇1、簇4和簇7中的次级代谢基因在*6公里*表S2中列出了在高氮中下调的、和簇8及其假定功能。

**图7。参与次级代谢的基因存在于H3K27me3区域，但并非所有基因都是由*公里t6*.**
A.NRPS（蓝色，顶部）、PKS（灰色，中间）和细胞色素P450（浅蓝色，底部）基因被定位到四条染色体上，与H3K27me3（低氮条件）相关。几乎所有基因都位于H3K27me3覆盖的区域。低氮条件下转录的变化以紫色表示为对数₂RPKM比值*kmt6与。*WT.B.热图显示三类SM基因、细胞色素P450s、PKS和NRPS的表达变化和H3K27me3富集。热图图例如图8所示。H3K27me3富集如对数所示₂NLCS的值。

**图8。特异性基因簇在*6公里*.**
A.镰刀菌素C簇中的所有基因均上调（A，FGSG_07797；B，FGSG_07798，*fus1/pks10*；C、 FGSG_13222，*模糊2*；D、 FGSG_13223，*模糊3*；E、 FGSG_07800，*模糊4*；F、 FGSG_07801，*模糊5*；G、 FGSG_07802，*模糊6*；H、 FGSG_07803，*模糊7*；一、 FGSG_07804，*模糊8*细胞色素P450；J、 FGSG_07805）。B.类胡萝卜素簇被去除*6公里*A.组蛋白修饰状态和类胡萝卜素生物合成基因的表达，*al-1/carB*植物烯脱氢酶；D、 FGSG_03066，*al-2/carRA*植物烯合酶；E、 FGSG_03067，*cao-1号机组*/*卡尔X*类胡萝卜素加氧酶；F、 FGSG_03068，*卡尔·R*转录调节因子；G、 FGSG_03069，二氢二吡啶酸合成酶；H、 FGSG_12520，环指蛋白；一、 FGSG_03070；J、 FGSG_03071，FAD依赖性氧化还原酶）。基因*基地-1*,*铝-2*和FGSG_03069是最强烈上调的，并且转录因子*卡尔·R*在低氮（log₂ = 1.63）和1.5倍高氮诱导（log₂ = 0.6）。在A和B中，日志₂-表达式中的倍数变化在x轴上有实线，在2（增加4倍）和6（增加64倍）处有虚线。仅显示具有统计意义的值(第页<0.001). C.缺乏KMT6会导致类胡萝卜素的产生，并在低氮水平（尤其是高氮水平）的培养液中积累。WT和kmt6在28C的温度下，在含有6 mM或60 mM NH的液体ICI中培养7天₄不₃.

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