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.2013年11月14日；5(3):791-801.
doi:10.1016/j.celrep.2013.09.046。 Epub 2013年10月31日。

果蝇光感受器分化和杆状体形态发生需要Xbp1非依赖性Ire1信号

迪娜·科埃略 1, 法蒂玛·卡里奥, 曾晓梅, 伊丽莎白·皮雷, 安娜·V·科埃略, 大卫·罗恩, Hyung Don Ryoo先生, 佩德罗·多明戈斯
附属公司

果蝇光感受器分化和杆状体形态发生需要Xbp1非依赖性Ire1信号

迪娜·科埃略等。 单元格代表. .

摘要

未折叠蛋白反应（UPR）由内质网中过度蛋白错误折叠激活的稳态信号通路组成。Ire1信号传导是UPR的重要介导物，导致转录因子Xbp1的激活。在这里，我们发现果蝇Ire1突变体光感受器在将视紫红质-1传递到杆粒和间隔细胞/眼睛闭入杆粒间隙的分泌方面存在缺陷。然而，在Xbp1突变的感光细胞中没有观察到这些缺陷。Ire1突变视网膜对调节的Ire1依赖性衰变（RIDD）靶点（包括脂肪酸转运蛋白（fatp））具有较高的mRNA水平。重要的是，RNAi对fatp的下调挽救了在Ire1突变感光细胞中观察到的视紫红质-1递送缺陷。我们的结果表明，Ire1在光感受器分化过程中的作用独立于Xbp1功能，并证明了RIDD机制在这一特定范式中的生理相关性。

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数字

图1
图1
Xbp1-EGFP-Ire1信号报告子在蛹期的光感受器中被激活。在所有面板中，UAS-Xbp1-EGFP（绿色）在GMR-Gal4的控制下表达，Elav（蓝色）是感光细胞中表达的神经元标记物。（A和B）三龄幼虫期眼/天线影像盘（后部在右侧）。（A） 在GMR-Gal4>UAS-Xbp1-EGFP中未观察到内源性GFP表达。（B） 在2 mM DTT中培养GMR-Gal4>UAS-Xbp1-EGFP影像光盘4小时，激活Xbp1-EGFP。（C） 24小时蛹未观察到Xbp1-EGFP。（D） 在蛹发育48小时和（E）72小时时，在感光细胞中观察到Xbp1-EGFP。（F） 在成人中，在一些同胸（红色）阳性晶格细胞中观察到Xbp1-EGFP，但在感光细胞中没有。（C和D）是全安装蛹眼的切线视图，（E和F）是眼睛的水平截面，指向顶部的远端。比例尺，10μm。
图2
图2
在中激活Xbp1-EGFP需要Ire1果蝇属eye（A）Ire1基因组区域示意图中国人民银行{WH}Ire1传真02170在Ire1的开放阅读框中插入piggyBac转座子。（B–E）三龄幼虫眼睛（右后）无眼的-Flipase诱导的克隆中国人民银行{WH}Ire1功能02170用2 mM DTT处理标记为无UAS-DsRed的纯合细胞4小时，以激活Xbp1-EGFP（绿色）。（B） 在纯合细胞中未观察到Xbp1-EGFP中国人民银行{WH}Ire1传真02170（C）Xbp1-EGFP在精确切除中国人民银行{WH}Ire1传真02170恢复基因组区域。（D） 在GMR-Gal4控制下或来自覆盖Ire1区域的（E）CH322-07H05（Pacman）基因组构建物的UAS-Ire1表达可挽救Xbp1-EGFP在中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞。（F–I）瞳孔（48小时）无眼的-Flipase诱导的中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞，标记为无UAS-DsRed。（F） 在纯合细胞中未观察到光感受器中的内源性Xbp1-EGFP中国人民银行{WH}Ire1传真02170（G）Xbp1-EGFP在精确切除中国人民银行{WH}Ire1传真02170（H）在GMR-Gal4控制下或来自（I）CH322-07H05（Pacman）基因组构建物的UAS-Ire1表达可挽救Xbp1-EGFP在中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞。埃拉夫穿着蓝色的衣服。比例尺，10μm。
图3
图3
Ire1是分泌spam/eys和形成缰间隙所必需的。（A） 三龄幼虫眼睛（右后）无眼的-Flipase诱导的克隆中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞标记为无ubiGFP（绿色），显示感光细胞规格标记Elav（蓝色）和Runt（红色）的正常表达（箭头）。（B） 40小时瞳孔中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞标记为无myrGFP（绿色），显示手臂（蓝色）和DaPKC（红色）的正常定位。（C） 50小时蛹PBac公司{WH}Ire1传真02170被myrGFP缺失标记的纯合细胞（绿色）显示出面包屑的正常定位（蓝色）。（D） 化蛹62小时，中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合子小眼畸形（无myrGFP，绿色）在缰间隙（IRS）中的Spam/Eys（蓝色）水平较低，目前在感光细胞体中保留有Spam/Ey。杆状体被肌动蛋白染色（红色）。放大的突变体和对照小眼畸形在图中用白色方块表示。（E）精确切除小眼畸形的克隆中国人民银行{WH}Ire1传真02170（无myrGFP，绿色）在IRS中的Spam/Eys（蓝色）定位正常。（F）GMR-Gal4>UAS-Ire1在中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合子小眼畸形（缺乏DsRed）。（G） CH322-07H05基因组构建挽救了Spam/Eys（蓝色）定位中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合小眼虫（无myrGFP，绿色）。（H） IRS规模量化；相邻纯合子突变体和野生型小蜂IRS面积比率的平均值。在图中所示的每个实验条件下，对大约40对突变型/野生型ommatidia进行了量化。比例尺为10μm。
图4
图4
Rh1输送到弹状体中需要Ire1。（A） 72小时瞳孔无眼的-Flipase诱导的克隆中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞被标记为无myrGFP（绿色），显示Rh1（蓝色）有缺陷地传递到杆粒（肌动蛋白，红色）。放大的突变体和对照小眼虫用白色方块表示。（B） Rh1（蓝色）进入杆状体在精确切除的克隆中是正常的中国人民银行｛WH｝红外线1传真02170（标记为缺少myrGFP，绿色）。（C） GMR-Gal4>UAS-Ire1表达将Rh1（蓝色）传递到中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞（标记为缺乏DsRed）。（D） CH322-07H05基因组构建物将Rh1（蓝色）释放到中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞（无myrGFP，绿色）。（E–G）中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合细胞（无myrGFP，绿色）降低了（E）BiP/GRP78（蓝色和单色）和（F）ninaA（蓝色和黑白）的水平（箭头），但没有（G）Cnx（蓝色和单色）。（H） 从yw（WT，阳性对照）、FRT82B成年头部蛋白提取物中提取的Rh1成熟（34kDa）和未成熟（40kDa中国人民银行{WH}Ire1功能02170/FRT82BCL，GMR-hid（整个眼睛由纯合子Ire1突变细胞组成（Stowers和Schwarz，1999）），ninaE17（Rh1蛋白缺失）和2个ninaA突变（ninaA1=尼娜A第228页和ninaAE110伏). Tubulin用作加载控制。比例尺，10μm。
图5
图5
间隔器/闭眼分泌物或Rh1输送到杆粒中不需要Xbp1。（A） Xbp1基因组区域示意图及定位P[lacW]Xbp1K13803型,P[PTT-GB]Xbp1（太平洋电信公司-英国）川B02061和P[SUPor-P]CG9418型KG05183公司。切除81和79删除了Xbp1的DNA结合域，并由P[PTT-GB]Xbp1型川B02061在切除81中，删除了Xbp1起始密码子（ATG）下游4bp至622bp的序列。在切除79中，删除了Xbp1起始密码子（ATG）上游260bp和下游748bp之间的序列。在切除250中，在CG15657和CG30389之间的基因间区，Xbp1的开放阅读框从起始密码子后的5bp开始，连同CG9418和CG15657一起被删除，直到2R:17036107。切除250是由P[SUPor-P]CG9418KG05183公司（B）化蛹62小时，无眼的-Flipase诱导的Excision 79纯合细胞克隆，标记为无myrGFP（绿色），在IRS中具有正常水平的Spam/Eys（蓝色）。杆状体用肌动蛋白染色（红色）。（C） 在蛹72小时时，Rh1（蓝色）被传递到用于切除79的纯合子感光体中的杆粒，标记为不存在myrRFP（红色），但Xbp1突变感光体的杆粒中Rh1水平低于野生型（野生型和突变小体的单色放大）。（D） 在蛹82小时时，切除79的纯合感光体在杆状体中的Rh1水平高于野生型。切除79个纯合光感受器显示出Rh1在杆聚合物中均匀分布，而野生型显示出典型的新月形浓度梯度，杆聚合物基底的浓度更高（单色放大）。（E） Rh1强度的量化。蛹发育72小时和82小时时，相邻的切除79纯合子和野生型小蜂对之间的Rh1荧光强度除以各自面积的平均值（Fluo例79/面积例79/流感病毒重量/面积重量). 每个时间点对约70对切除79个纯合子和野生型小眼畸形进行量化。在蛹72小时时，切除79个纯合子感光器降低了（F）BiP/GRP78（蓝色和单色）和（G）ninaA（蓝色和黑白）的水平，但没有降低（h）Cnx（蓝色和单色）的水平。比例尺，10μm。
图6
图6
RIDD对Fatp的调节对于杆状体形态发生至关重要（A）定量RT-PCR比较对照组RIDD靶点（X轴）的mRNA水平（Y轴）（蓝色条，yw公司)和Ire1突变眼（绿色条，依Flp；FRT82B型中国人民银行{WH}Ire1传真02170/FRT82B，CL，GMR-hid）。mRNA水平以相对于对照组的任意单位（折叠变化）表示(yw公司). （B） 的克隆中国人民银行{WH}Ire1功能0217072小时内，纯合子小蜂（无myrGFP，绿色，用白色虚线表示）蛹的Fatp（蓝色和单色）水平高于周围对照组织。（C） 成人对照眼（GMR-Gal4）在杆粒中Rh1（蓝色）定位正常。（D） 成人GMR-Gal4>uas-Fatp眼睛的Rh1（蓝色）向触角体输送有缺陷（箭头）。（E） GMR-Gal4>uas-Fatp RNAi在克隆的中国人民银行{WH}Ire1传真02170纯合子小眼畸形（与图4A相比），以及（F）GMR-Gal4>uas-LPP。如图所示，杆状体被肌动蛋白染成红色或绿色。比例尺，10μm。
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