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.2013年12月；2(12):975-82.
doi:10.5966/sctm.2013-0077。 Epub 2013年10月28日。

脱细胞饲养器：一种培养多能干细胞的优化方法

林美玲 1, 菲利普·容格布卢斯, 塞巴斯蒂安·谢奎斯特, 英雄Nikdin, 克里斯汀·洛斯·克雅坦斯多蒂尔（Kristín Rós Kjartansdóttir）, 文德华, 伊万·瓦斯列夫, 保罗·马奇亚里尼
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脱细胞饲养器：一种培养多能干细胞的优化方法

林美玲等。 干细胞Transl Med. 2013年12月.

摘要

多能干细胞（如人类胚胎干细胞和人类诱导的多能干电池）在再生医学领域非常有用，因为它们可以无限增殖并分化为所有类型的细胞。然而，维持和繁殖干细胞的一个限制因素是需要灭活的成纤维细胞作为生长基质，因为这些可能会导致交叉污染。在这项研究中，我们的目的是将干细胞维持在未辐照或γ辐照的成纤维细胞的细胞外基质（ECM）上。已经证明，ECM含有对多能干细胞的粘附、增殖和分化至关重要的因子和蛋白质。为了保存ECM，用0.05%十二烷基硫酸钠（SDS）处理成纤维细胞的细胞层，使其脱细胞，与传统饲养层培养相比，这导致DNA缺失。然而，SDS处理并未引起ECM结构和完整性的可检测变化。此外，免疫组织化学表明，主要ECM蛋白，如纤连蛋白、胶原和层粘连蛋白的表达保持不变。在脱细胞基质上培养的人类多能干细胞保持多能干标记NANOG和OCT4的基因表达，并具有分化为三个胚层的潜能。这里显示的体外培养系统具有很好的潜力，因为主要的同种异体成分（即饲养细胞的DNA）被去除。这也是一种技术上简单、快速、安全和廉价的方法，用于维持精细的无饲料干细胞培养，以进行进一步的细胞分化研究。

关键词：细胞培养；细胞外基质；多能干细胞；脚手架附着区域；无血清培养基；干细胞；干细胞培养；技术。

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数字

图1。
图1。
用0%（对照）、0.01%、0.05%和0.1%浓度的SDS处理的人包皮成纤维细胞的形态学和组织学图像。（A–D）：扫描电子显微镜的形态图像。放大倍数：×200（A）, ×1,600（B）, ×900（C）, ×1,700（D）.（E–H）：相位对比显微镜。放大倍数，×20。（I–P）：采用Masson三色染色法对饲养层细胞外基质的脱细胞作用进行组织学评估（I–L）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（M–P）.（I，M）：对照饲养细胞采用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）方案制备；通过Masson三色染色和DAPI染色，DPBS含有完整的细胞核。放大倍数：×20（I–K，M–P）, ×40（左）缩写：DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；十二烷基硫酸钠；SEM、扫描电子显微镜。
图2。
图2。
用0%（对照）、0.01%、0.05%和0.1%浓度的十二烷基硫酸钠处理的γ射线照射人包皮成纤维细胞的形态学和组织学图像。（A–D）：扫描电子显微镜的形态图像。放大倍数：×400（A）, ×250（B）, ×250（C）, ×600（D）.（E–H）：相位对比显微镜。放大倍数，×20。（I–P）：采用Masson三色染色法对饲养层细胞外基质的脱细胞作用进行组织学评估（I–L）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（M–P）.（I，M）：对照饲养细胞用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）方案制备；通过Masson三色染色和DAPI染色，DPBS含有完整的细胞核。放大倍数，×20（I–P）缩写：DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；十二烷基硫酸钠；SEM、扫描电子显微镜。
图3。
图3。
HFF细胞外基质支架中残留基因组DNA的浓度（即未辐照或γ辐照）。对照组基因组DNA数量的差异是由于脱细胞过程之前细胞数量的差异所致。*，第页< .05. 缩写：HFF，人包皮成纤维细胞；十二烷基硫酸钠。
图4。
图4。
用0%（对照）、0.05%和0.1%十二烷基硫酸钠处理的未辐照人包皮成纤维细胞的特性。脱细胞饲料基质的代表性图片如下：胶原蛋白I（A–C），IV型胶原蛋白（D–F），层粘连蛋白（G–I），弹性蛋白（J–L）和纤维连接蛋白（M–O）。放大倍数，×20。缩写：ColI，胶原蛋白I；ColIV、胶原蛋白IV。
图5。
图5。
用0%（对照）、0.05%和0.1%十二烷基硫酸钠处理的γ射线照射人包皮成纤维细胞的特性。脱细胞饲料基质的代表性图片如下：胶原蛋白I（A–C），IV型胶原蛋白（D–F），层粘连蛋白（G–I），弹性蛋白（J–L）和纤维连接蛋白（M–O）.放大倍数，×20。缩写：ColI，胶原蛋白I；ColIV、胶原蛋白IV。
图6。
图6。
在未辐照的细胞上播种多能干细胞（A–D， I–L）和γ辐照（E–H、M–P）用0%（对照）、0.01%、0.05%和0.1%十二烷基硫酸钠处理的人包皮成纤维细胞。放大倍数：×20，（A–D，E–H）, ×200（I、O）, ×300（K、L、N、P），×350（J， M）所示为相位对比显微镜下人类胚胎干细胞种子的形态图像（A–H）种子诱导多能干细胞的扫描电镜形态图像（I–P）缩写：SDS，十二烷基硫酸钠。
图7。
图7。
在未经辐照的人包皮成纤维细胞上评估人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）。（A、B）：多能性标记OCT4免疫细胞化学染色的代表性图像（A）和相位（B）.放大倍数，×20。（C） 以下为：OCT4和NANOG在hESCs和hiPSCs中的基因表达，归一化为常规培养板。*，第页< .05.（D–L）：体外多能干细胞向外胚层染色阳性的三个不同胚层分化（巢蛋白【D】，阶段[英]，和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚[DAPI][女])，内胚层（GATA6【G】，阶段【H】、和DAPI[我])和中胚层（结蛋白[日本]，阶段【K】和DAPI【L】). 放大倍数，×20。
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