Mesenchymal stem cells enhance autophagy and increase β-amyloid clearance in Alzheimer disease models

doi:10.4161/auto.26508

.2014年1月；10(1):32-44.

doi:10.4161/auto.26508。 Epub 2013年1月1日。

阿尔茨海默病模型中间充质干细胞增强自噬并增加β-淀粉样蛋白清除率

金永信¹, Hyun Jung公园¹, 哈娜·金¹, Se Hee哦¹, Jae-Sung Bae公司², Hee-Jin哈^三, 李惠贤¹

附属公司

¹神经与大脑研究所；延世大学医学院；韩国首尔；西弗伦斯生物医学科学研究所；延世大学；韩国首尔。
²生理学系；医学院；京浦国立大学；韩国大邱。
^三药学学院；成均馆大学；韩国水原。

PMID： 24149893
预防性维修识别码：项目经理4389879
内政部： 10.4161/自动26508

阿尔茨海默病模型中间充质干细胞增强自噬并增加β-淀粉样蛋白清除率

金永信等。自噬. 2014年1月.

.2014年1月；10(1):32-44.

doi:10.4161/auto.26508。 Epub 2013年1月1日。

作者

金永信¹, Hyun Jung公园¹, 金哈娜¹, Se Hee哦¹, Jae-Sung Bae公司², Hee-Jin哈^三, 李惠贤¹

附属公司

¹神经与大脑研究所；延世大学医学院；韩国首尔；西弗伦斯生物医学科学研究所；延世大学；韩国首尔。
²生理学系；医学院；京浦国立大学；韩国大邱。
^三药学学院；成均馆大学；韩国水原。

PMID： 24149893
预防性维修识别码：项目经理4389879
内政部： 10.4161/自动26508

摘要

目前的证据表明，自噬在阿尔茨海默病（AD）中起着核心作用，自噬系统的功能障碍可能导致淀粉样蛋白-β（aβ）的积累。利用体外和体内AD模型，本研究研究了间充质干细胞（MSCs）是否可以通过调节aβ清除率来增强自噬，从而发挥神经保护作用。在aβ处理的神经元细胞中，MSCs与仅用aβ处理过的细胞相比，提高了细胞活力并增强了LC3-II的表达。免疫荧光显示，Aβ处理的神经元细胞中MSC共培养增加了与溶酶体标记物共定位的LC3-II阳性自噬体的数量。超微结构分析显示，Aβ处理细胞中的大多数自噬空泡（AVs）没有与溶酶体融合，而与Aβ处理的神经元细胞共培养的MSCs中的大部分自噬体与溶酶体连在一起。此外，与Aβ处理细胞相比，MSC共培养显著增加了溶酶体内共定位的Aβ免疫反应性，并降低了细胞内的Aβ水平。在Aβ治疗的动物中，MSC的给药显著增加了自噬体诱导、晚期AV的最终成熟以及与溶酶体的融合。此外，MSC的给药显著降低了海马中Aβ的水平，Aβ处理的小鼠海马中的Aβ水平升高，同时海马神经元的存活率增加。最后，MSC共培养上调AD模型中BECN1/Beclin 1的表达。这些结果表明，MSCs显著增强了AD模型中Aβ的自溶体形成和清除，这可能会提高神经元抵抗Aβ毒性的存活率。利用MSC调节自噬途径修复受损AD大脑将对AD治疗的未来策略产生重大影响。

关键词：阿尔茨海默病；BECN1；β淀粉样蛋白；自噬；间充质干细胞。

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数字

**图1。**Aβ诱导SH-SY5Y细胞自噬体的形成。SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度的Aβ（Aβ_1–42)持续24或72小时。细胞活力以剂量和时间依赖的方式降低(**A和B**). 然而，反向肽Aβ_42–1处理（24和72小时20μM）未导致形态变化或细胞活力丧失。Aβ治疗增强了自噬标记物（LC3）。Western blot分析表明，Aβ治疗以剂量和时间依赖性的方式增加LC3-II的表达(**C和D**). 数值表示为平均值±*标准偏差*，n=3**P（P）*Aβ处理后的SH-SY5Y细胞与未处理的SH-SY细胞相比<0.05；^# *P（P）*Aβ处理的SH-SY5Y细胞在24小时时<0.05，而Aβ处理SH-SY5细胞在72小时时<0.05。

**图2。**MSCs增加Aβ处理的SH-SY5Y细胞的细胞活力并增强自噬诱导。Aβ处理的SH-SY5Y细胞与MSCs共培养3、6、12或24小时。与基线相比，MSC共培养12小时后显著提高了Aβ处理SH-SY5 Y细胞的活力(A类). 此外，与Aβ处理的细胞相比，MSCs增强了Aβ处理细胞中LC3的表达。条形图说明了LC3-II/LC3-I的量化(**B和C**). 数值表示为平均值±*标准偏差*，n=3**P（P）*与未处理的SH-SY5Y细胞相比，Aβ处理的SH-SY5Y细胞<0.05；^# *P（P）*Aβ处理的SH-SY5Y细胞与MSCs共培养的SH-SY5Y细胞相比<0.05。

**图3。**MSCs促进自溶体的形成。免疫荧光显示，与Aβ处理的SH-SY5Y细胞相比，在Aβ处理过的SH-SY细胞中共培养的MSC增加了6和12小时与溶酶体（Cy3；红色）共定位的LC3阳性自噬体（FITC；绿色）的数量(A类). 定量分析Aβ处理的SH-SY5Y细胞中每个细胞的FITC和Cy3双阳性点表明，与Aβ处理细胞相比，MSC共培养显著增强了自溶体的形成(B类)，数据是3个独立实验的平均值，每个实验不少于100个细胞）。此外，MSC共培养增加了Aβ处理的SH-SY5Y细胞的溶酶体活性(C类)CQ处理显著降低了细胞存活率，与MSCs共培养时细胞存活率增加(D类). 数值表示为平均值±*标准偏差*，n=3**P（P）*Aβ处理后的SH-SY5Y细胞与未处理的SH-SY细胞相比<0.05；^# *P（P）*Aβ处理的SH-SY5Y细胞与MSC共培养的SH-SY5Y细胞相比<0.05；^§ *P（P）*MSC共培养的SH-SY5Y细胞与CQ和MSC共培育的SH-SY5Y细胞相比<0.05。比例尺：5μm。

**图4。**MSCs增强CHO细胞的自噬调节，稳定表达人APP695。CHO细胞与MSCs共培养6 h。与无MSCs的细胞相比，与MSCs共同培养的CHO细胞中LC3和RAB7的表达显著增加(**A和C**). 条形图说明LC3-I/II比率和相对RAB7表达的量化(**B和D**). 此外，CHO细胞与MSCs共培养后细胞内Aβ水平降低，但差异没有达到统计学意义(E类). 数值表示为平均值±*标准偏差*s（SD），n=3**P（P）*CHO细胞与MSCs共培养的CHO细胞相比<0.05。

**图5。**超微结构分析表明，MSCs上调Aβ处理的SH-SY5Y细胞中自溶体的形成。未经Aβ处理的SH-SY5Y细胞中很少发现自噬体**（A）**在Aβ处理的SH-SY5Y细胞中观察到的大多数自噬小泡没有与溶酶体融合(**B和C**); 然而，MSC共培养导致大量自噬体与溶酶体结合(**D和E**). 黄色箭头表示自噬体，红色箭头表示自溶体。比例尺：10000纳米。

**图6。**MSCs通过自噬-溶酶体途径增强Aβ清除。我们评估了溶酶体中共定位的Aβ及其细胞内浓度，以确定MSCs诱导的自噬是否增强了Aβ的清除。对每个细胞Aβ（绿色）和LC3（红色）双阳性点的免疫荧光分析表明，与Aβ处理的细胞相比，与MSCs共培养的SH-SY5Y细胞自噬体内的Aβ没有改变(**A和B**). 然而，与Aβ处理的细胞相比，在Aβ处理细胞中共培养的MSCs增加了在溶酶体中共定位的Aβ免疫反应性（绿色）（红色）(**C和D**). MSC共培养显著降低Aβ处理的SH-SY5Y细胞内Aβ水平，其中Aβ浓度以时间依赖的方式逐渐增加(E类). 数据是3个独立实验的平均值，每个实验不少于100个细胞。数值表示为平均值±*标准偏差*，n=3**P（P）*Aβ处理后的SH-SY5Y细胞与未处理的SH-SY细胞相比<0.05；^# *P（P）*Aβ处理的SH-SY5Y细胞与MSCs共培养的SH-SY5Y细胞相比<0.05。比例尺：5μm。

**图7。**间充质干细胞通过自噬增强Aβ的降解，在AD动物模型中发挥神经保护作用。与对照组相比，Aβ处理的小鼠海马中RBFOX3阳性细胞和Nissl染色细胞显著减少(**A和B**)而MSC给药显著提高了脑内RBFOX3阳性细胞和Nissl染色细胞的存活率**（C）**在体视学分析中，与对照组相比，Aβ治疗组小鼠海马中RBFOX3阳性细胞显著减少(**A和B**)而MSC给药显著提高了AD动物脑中海马神经元的存活率(D类). 在AD动物中给予MSC后，LC3-II/LC3-I的比率显著增加(E类)和RAB7表达(F类). 此外，MSC的给药降低了Aβ免疫反应性(**G到I**)和Aβ水平(J型)与仅经Aβ处理的小鼠相比。超微结构分析表明，在正常小鼠中很少发现自噬体(**K到M**)而未与溶酶体融合的自噬小泡在Aβ处理的小鼠中异常积聚(**N到P**). 相反，MSC给药诱导了大量与溶酶体融合的自噬体(**Q到S**). 黄色箭头表示自噬体，红色箭头表示在每组中观察到的自溶体。数值表示为平均值±*标准偏差*，n=4**P（P）*与对照小鼠相比，Aβ处理的小鼠<0.05；^# *P（P）*Aβ处理小鼠与MSCs处理小鼠之间的差异<0.05。比例尺：50µm(**A–C**); 10000纳米(**H、 K和N**); 5000纳米(**一、 L和O**); 2000纳米(**J、 M和P**).

**图8。**MSCs在体内外促进BECN1的表达。与Aβ处理的细胞相比，Aβ处理后的SH-SY5Y细胞与MSCs共培养6和12小时后，BECN1表达显著增加(**A和B**). 此外，与Aβ处理的小鼠相比，Aβ处理小鼠的MSC给药导致BECN1表达显著增加(**C和D**). 数值表示为平均值±*标准偏差*，n＝3**P（P）*Aβ处理的SH-SY5Y细胞或小鼠与SH-SY5细胞或对照小鼠之间的差异<0.05；^# *P（P）*Aβ处理的SH-SY5Y细胞或小鼠与MSCs处理的SH_SY5Y电池或小鼠之间的差异<0.05。

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