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.2013年10月11日；8（10）：e76845。
doi:10.1371/journal.pone.0076845。 2013年电子收集。

转录抑制复合物BCL-6/BCoR的过度表达导致核聚集体不同于经典攻击

伊丽莎白·布赫伯格 1, 米里亚姆·埃尔·哈奇, 迪特马尔·帕胡贝尔, 安娜·佐默, 多米尼克·绍尔, 英格丽德·西蒙尼施·克鲁普, 马丁·比尔班, 克里斯汀·布罗斯坦
附属公司

转录抑制复合物BCL-6/BCoR的过度表达导致不同于经典聚集体的核聚集

伊丽莎白·布赫伯格等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

聚集蛋白质的核内含物主要用于具有异常聚谷氨酰胺重复序列的分子以及突变或结构改变的蛋白质。它们被称为“核攻击物”，错误折叠被证明可以促进与分子伴侣和蛋白酶体的联系。这里，我们报道野生型氨基酸序列的转录抑制复合物（BCL-6和BCoR）的两个组分在过度表达时可以独立或联合诱导核聚集体的形成。大多数细胞迅速下调BCL-6/BCoR水平的观察结果支持了这种观点，即这些蛋白的表达受到严格控制。当BCL-6/BCoR表达超过内源性水平的150倍时，就会出现内含物。它们优先在细胞核中发育，聚集大小逐渐增大，形成与热休克蛋白无关或以泛素为标志的大球体结构。相反，我们发现BCL-6/BCoR内含物与PML小体密切相关，组蛋白脱乙酰酶或热休克蛋白70的伴随过度表达导致聚集减少。总之，我们的数据提供了不同于经典“核攻击体”的核聚集体的观点：大的球状结构复合体可以在细胞核中进化，而不必以蛋白质重折叠和降解的细胞机制为标志。然而，核蛋白平衡可以通过平衡伴侣的水平来恢复。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：这项工作得到了Oesterreichische国家银行周年基金的支持(http://www.oenb.at/de/ueber_die_oenb/foerderung/jubilaemsfonds/jubilaeumsfonds.jsp)，项目编号：12678。这并不会改变我们对所有PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。初级内皮细胞过度表达后BCL-6/BCoR蛋白的分布。
用EFp-BCL-6（A）、EFp-BCoR-A（B）或两种表达质粒的组合（C）转染内皮细胞。转染后24小时，将细胞固定并用抗BCL-6和/或BCoR的抗体染色用于CLSM成像。应用Hoechst 33342对细胞核DNA进行反染色。BCL-6和BCoR蛋白的共同定位区域用黄色表示；未转染的细胞用星号标记。比例尺：5µm。用0、2、10或20µg EFp-BCL-6转染（D和E）EC。通过添加EFp-Link对照载体将DNA总量调节至20µg，以标准化转染条件。12小时后，用BCL-6抗体和Hoechst 33342 DNA染色对细胞进行免疫染色，并用适于自动分析粘附细胞培养物中染色强度的TissueFAXS荧光检测系统进行分析。模拟处理对照用于测定内源性蛋白质水平。转染细胞中BCL-6的表达以平均对照的倍数给出，并分为低（>2倍）、中（>4倍）和高（>6倍）强度。用10µg EFp-BCL-6转染的DNA和BCL-6荧光在340毫秒检测中记录的散点图如（D）所示。为了获得更好的高表达分辨率，再次扫描25毫秒（E）。表1列出了转染细胞的频率、低表达、中表达和高表达的百分比以及核聚集体的出现情况。
图2
图2。BCL-6/BCoR包裹体的结构和核重组。
用EFp-BCL-6（A）或EFp-BCoR-A（B和C）表达质粒转染内皮细胞，24小时后用Hoechst 33342 DNA染色和BCL-6或BCoR抗体进行CLSM成像。（A和B）将Z堆栈序列编译为正交投影。（C） BCoR-A转染细胞的荧光和透光（灰度）图像的比较。比例尺：5µm。
图3
图3。骨料形成的时间过程。
（A） 用EFp-BCL-6或EFp-BCoR-A质粒转染内皮细胞，并分别使用BCL-6和BCoR抗体在4至24小时后进行CLSM成像。应用Hoechst 33342对细胞核DNA进行反染色。箭头表示小的点状结构；箭头指向聚集体的大球体。（B） EC转染EGFP-BCL-6表达质粒后，在转染后8至12小时进行细胞处理以进行CLSM成像。箭头表示细胞核和胞浆中的小点状结构；箭头指向弥漫的核周堆积物。右上角的图像显示了一个大的球形EGFP-BCL-6聚集体，它位于细胞核破碎的细胞中。（C） 在EC转染BCL-6或BCoR-A表达质粒后12 h测定每个核的聚集物直径和数量。根据Spearman检验，BCL-6（rho=-0.697，p<0.01）和BCoR（rho=0.503，p<0.01）呈显著负相关，具有统计学意义。比例尺：5µm。
图4
图4。BCL-6/BCoR在细胞周期进程中聚集。
（A） 转染EFp-BCL-6或EFp-BCoR-A的内皮细胞的共聚焦图像，培养18小时，然后加载BrdU 1小时。用BCL-6和BCoR抗体以及BrdU和H3（pS28）抗体对细胞进行免疫染色，以分别检测S期或有丝分裂期的内皮细胞。G0/G1期的细胞通过BrdU和H3（pS28）染色的缺失来反映。（B） EFp-BCL-6或EFp-BCoR-A转染内皮细胞的共焦图像，用BCL-6抗体或BCoR抗体和DNA染色Hoechst 33342处理，以说明相邻细胞中细胞溶质聚集物的出现。（C） 根据（A）中所示的共聚焦图像，2000个细胞被计数并分类为G0/G1、S或M/G2期。比较BCL-6阳性和阴性（未转染）细胞群体的细胞周期分布。（D） 转染EGFP-BCL-6或EGFP-C3对照质粒后2至24小时，通过PI染色和流式细胞术测定内皮细胞的细胞周期分布。仅评估EGFP阳性细胞。比例尺：5µm。
图5
图5。BCL-6/BCoR聚集细胞内内源性HSP70表达。
用EFp-BCL‑6、EFp-BCoR-A、EGFP-BCL-6或EGFP-C3质粒转染内皮细胞，转染12小时后进行CLSM成像。所有细胞均用α-HPS70抗体和Hoechst 33342染色。用BCL-6或BCoR抗体对EFp-BCL-6和EFp-BCoR-A转染细胞进行进一步免疫染色。没有HSP70关联的BCL‑6/BCoR聚集物用箭头表示。共同定位区域用箭头表示，并用黄色标记。比例尺：10µm（适用于所有面板）。
图6
图6。外源性HSP70和HSP90共同表达后BCL-6聚集形成。
将EFp-BCL‑6与HSP70-1A或HSP90-HA表达质粒或EFp-Link控制载体联合转染内皮细胞。12和24小时后，用BCL-6和HSP70抗体或BCL-6抗体和HA-tag抗体对细胞进行CLSM染色，以检测HSP90。应用Hoechst 33342对细胞核DNA进行反染色。（A） CLSM图像显示转染后24小时BCL-6与HSP70或HSP90同时过度表达（比例尺：10µM）。（B） BCL-6阳性细胞的百分比是通过四次随机获得的瓷砖扫描（40倍客观）测定的，扫描覆盖了大约700个细胞。给出了两个独立实验的平均值和标准偏差；T检验显示无统计学显著差异。（C） 对随机选择的35个BCL-6聚集的细胞核进行分析（按条件），以确定其聚集物的直径。箱线图显示了在12小时（T检验；p<0.001）和24小时（T检测；p=0.001）后HSP70共同表达时，获得值的分布以及骨料直径的统计学显著降低。（D） 300个BCL-6阳性细胞（每种情况）根据其核BCL-6表达模式分为弥散（无聚集）、小点状、大球形和额外的细胞溶质聚集。平均值和标准偏差由两个独立实验计算得出。24小时后BCL-6和HSP70共同表达后，大的球形聚集物的频率显著降低（T检验；p=0.031）。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图7
图7。蛋白酶体阻断对BCL-6聚集体形成的影响。
将EFp-BCL‑6与HSP70-1A或EFp-Link控制载体联合转染内皮细胞。转染后3小时，将细胞暴露于0.5µM MG132或不处理。转染后24小时，用抗BCL-6和HSP70的抗体或抗BCL-6和泛素的抗体（包括Hoechst 33342作为DNA复染剂）对EC进行CLSM成像染色。（A） 显微镜图像显示BCL-6、HSP70和泛素的表达模式（比例尺：20µM）。（B） BCL-6阳性细胞的百分比是通过四次随机获得的瓷砖扫描（40倍客观）测定的，扫描覆盖了大约700个细胞。给出了两个独立实验的平均值和标准偏差。添加MG132后，BCL-6阳性细胞的频率显著增加（T检验；p=0.01）。（C） 对随机选择的35个BCL-6聚集的细胞核进行分析（按条件），以确定其聚集物的直径。箱线图显示了HSP70共表达时获得值的分布，聚集粒径在统计学上显著减小（T检验；p<0.001），MG132治疗部分逆转了该现象（T检验，p=0.028）。（D） 300个BCL-6阳性细胞（每种情况）根据其核BCL-6表达模式分为弥散（无聚集）、小点状、大球形和额外的细胞溶质聚集。平均值和标准偏差由两个独立实验计算得出。BCL-6和HSP70共同表达后，大的球形聚集体的频率显著降低（T检验；p=0.025）。MG132的作用无统计学意义，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图8
图8。过度表达的BCL-6/BCoR蛋白与HDAC的相关性。
用FLAG标记的表达构建物HDAC1（A）、HDAC3（B）、HDAC4（C）、HDAC 5（D）、HDAC6（E）或HDAC7（F）转染内皮细胞，并在转染FLAG标记抗体和DNA染色后12小时进行CLSM成像处理（Hoechst 33342）。第一条通道显示HDAC分布，没有伴随BCL-6/BCoR过度表达。所有其他图像均来自于联合转染HDAC表达结构和EFp-BCL-6或EFp-BCoR-A质粒的内皮细胞。此外，用BCL‑6或BCoR抗体对细胞进行染色。最后一个面板显示指示区域的放大倍数（白色矩形）。合并图片中的箭头和箭头指向HDAC与BCL-6或BCoR共同本地化的区域。比例尺：5µm（适用于所有面板）。
图9
图9。BCL-6/BCoR聚集体对PML小体核分布的影响。
用EFp-BCL-6或EFp-BCoR-A DNA转染内皮细胞，24小时后进行CLSM成像。抗BCL-6或BCoR抗体与α-PML抗体结合进行免疫染色。PML主体与小点状BCL-6/BCoR骨料的关联用箭头标记。箭头表示PML蛋白在大球体包涵体边缘合并。比例尺：5µm。
图10
图10。BCL-6/BCoR聚集体与核孔复合体成分的关系。
用EFpBCL-6或EFp-BCoR-A（A）或两种质粒的组合（B）转染内皮细胞。12小时后，用Hoechst 33342 DNA染色和抗NUPs、BCL-6和BCoR的抗体处理细胞，用于CLSM成像。比例尺：5µm（适用于所有面板）。最后一条车道显示指示区域的放大倍数（白色矩形）。
图11
图11。BCL‑6/BCoR转染内皮细胞质粒DNA、mRNA和蛋白质含量的比较。
用EFp-BCL-6或EFp-BCoR-A表达质粒转染细胞。（A） 通过细胞提取物的qPCR测定每个细胞的质粒数量。结果代表了3个独立实验的平均值和标准偏差。（B） 通过相应RNA提取物的qRT-PCR测定mRNA相对于内源性水平的增加。（C） 通过渗透细胞的流式细胞术评估蛋白质表达，并以BCL-6/BCoR阳性EC的百分比表示。
图12
图12。EGFP-BCL-6表达的时间进程与细胞死亡的关系。
用EGFP-BCL-6或EGFP-C3控制质粒转染内皮细胞。死亡细胞和活细胞的区分基于内皮细胞的特性，即死亡细胞在培养中分离，分离的细胞在悬浮液中不能存活。因此，采集活（粘附）细胞和死（非粘附）细胞，并通过流式细胞术分析EGFP荧光。比较转染后24小时内活细胞（A）和死细胞（B）中EGFP-BCL-6或EGFP阳性细胞的百分比。（C） 粘附细胞群的PI染色用于检测具有坏死或晚期凋亡特征的细胞（G1以下DNA含量）。仅评估EGFP阳性细胞。从两个独立的实验中计算平均值和标准偏差。
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这项工作得到了Oesterreichische国家银行周年基金的支持(http://www.oenb.at/de/ueber_die_oenb/foerderung/jubilaemsfonds/jubilaeumsfonds.jsp)，项目编号：12678。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。本研究没有收到额外的外部资金。