α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection

doi:10.1523/JNEUROSCI.1869-13.2013

.2013年10月16日；33(42):16540-51.

doi:10.1523/JNEUROSCI.1869-13.2013。

α2-Chimaerin在动眼神经投射发育过程中调节关键的轴突引导转变

克里斯托弗·克拉克¹, 奥利弗·奥斯汀, 伊万娜·波帕里克, 莎拉·古思里

附属公司

PMID： 24133258
预防性维修识别码：项目经理3797374
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.1869-13.2013年

α2-Chimaerin在动眼神经投射发育过程中调节关键轴突导向过渡

克里斯托弗·克拉克等。神经科学. 2013.

.2013年10月16日；33(42):16540-51.

doi:10.1523/JNEUROSCI.1869-13.2013。

作者

克里斯托弗·克拉克¹, 奥利弗·奥斯汀, 伊万娜·波帕里奇, 莎拉·古思里

附属

¹英国伦敦SE1 1UL盖伊校区国王学院发育神经生物学MRC中心。

PMID： 24133258
预防性维修识别码：项目经理3797374
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.1869-13.2013年

摘要

眼球运动系统由三条神经组成，这些神经支配六块肌肉来控制眼球运动。在人类中，该系统发育缺陷会导致眼球运动障碍，如Duane Retraction Syndrome，这可能是由α2-嵌合体信号分子突变引起的。我们用斑马鱼模拟了α2-嵌合体在眼球运动系统发育过程中的作用。我们首先绘制了发生在受精后24至72小时（hpf）之间的眼球运动时空发展图，其中眼球运动神经遵循一个不变的生长序列，并向其肌肉靶点分支。我们确定当动眼神经轴突到达眼眶并选择肌肉靶点时，52 hpf是轴突引导“过渡”的关键。实时成像和定量显示，在52 hpf时，轴突发生行为转换，丝状体动力学发生显著变化。我们测试了α2-嵌合体在这一引导过程中的作用，发现表达功能丧失α2-嵌体异构体的轴突未能在丝足动力学中经历52 hpf的转变，导致轴突停滞。α2-奇马林功能丧失导致动眼神经轴突的生态错觉和误导性分支及发育不全；根据视动反射测量，胚胎有缺陷的眼球运动。体外操纵动眼神经细胞中的嵌合体信号导致微管稳定性的改变。这些发现表明，关键的动眼神经轴突导向决策需要α2-嵌合体信号的正确水平，并为Duane Retraction Syndrome提供了斑马鱼模型。

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数字

**图1。**
眼球运动系统的早期发育。现场的多光子横向视图*岛屿1:GFP*(A类,B类,D类,E类,***G公司***,***H（H）***,J型)，α-*法案：RFP*(***M（M）***)、和*岛屿1:GFP*× α-*法案：RFP*(N个)胚胎或wt胚胎α-微管蛋白免疫染色(K)在指定的阶段。nIII，动眼神经核；nIV，滑车核；nV，三叉神经核。30 hpf时眼球运动发育示意图(C类)，44马力(F类)，48马力(我)和54 hpf(***L（左）***).O（运行），斑马鱼头部48 hpf的示意图，以蓝色显示OMN、成像区域（蓝色方形）和方向。D、多萨尔；R、嘴侧；te，顶盖；hb，后脑；ov，耳囊。蓝色、绿色和红色分别代表OMN、滑车和外展神经；灰色代表肌肉祖细胞；橙色代表肌球蛋白阳性肌肉。所有面板的方向都是左吻，背对顶部。A类，虚线表示神经管的边缘。***H（H）***，虚线表示动眼神经背侧亚核之间的假定细分。圆点代表睫状神经节。K，*三叉神经分支。黄色和红色箭头分别表示MR和IR肌肉的神经分支；蓝色箭头表示指向IO肌肉的神经分支。比例尺，50μm。

**图2。**
眼球运动系统发育的后期阶段。α-微管蛋白免疫染色wt胚胎的多光子成像侧视图(A类,D类)，突触前小泡（SV2）(***G公司***,我)或乙酰胆碱受体（αBgt）(J型)在指定的阶段。K，两者的合并图像我和J型（这些图像中的红色圆圈表示视网膜的背景染色）。实时图像的蒙太奇*岛1-GFP*带有α-*微管蛋白*和肌球蛋白重链(*我的HC*)免疫染色显示72 hpf时OMN和滑车神经的通路(C类). Zn-5抗体免疫染色的wt胚胎的多光子腹视图(F类). r5,6，菱汞5,6。α-actin:RFP胚胎在72 hpf时的活多光子侧视图(***H（H）***). 黄色和红色箭头分别表示MR和IR肌肉的神经分支；蓝色箭头表示指向IO肌肉的神经分支；白色箭头表示SR肌肉的神经分支。A类,B类，*三叉神经分支。F类,***G公司***箭头和箭头表示外展神经。66 hpf时眼球运动发育示意图(B类)和72 hpf(E类)如图1所示。所有面板，除F类如图1所示。比例尺，50μm。

**图3。**
单个OMN神经元的成像。OMN表达中单个神经元的活体成像*GFP公司*之前(A类)或之后(B类)过渡点。箭头表示丝状伪足。生活想象(C类)和荧光萃取(D类)在63 hpf产生不同分支的OMN内神经元的图像。彩色箭头表示不同的神经投射。单个神经元表达*绿色荧光蛋白，野生型-α2-chn-WT*或*G228S型*-α*2-通道*之前的突变形式(E类)或之后(F类)52hpf的转变点。黄色箭头表示树枝长入肌肉区域*分支/停转点。箭头表示从分支点向后的神经投射。过渡点后在这些胚胎中观察到的表型示意图(***G公司***)停滞不前*G228S型*-α*2-通道*-表达神经元。在某些情况下，虚线表示投影朝向背面。所有面板的方向都是左吻，背对顶部。比例尺，25μm。

**图4。**
52 hpf过渡期间的丝足动力学。A类，单幅插图*GFP公司*-OMN中与MR/IR祖细胞接触的表达神经元*α-肌动蛋白RFP*行。B类，单个神经元表达*GFP、WT*-α*2-通道*或*G228S型*-α*2-通道*在52hpf转换前后均形成突变*第页<0.001.n个= 9,n个=4，和n个=5个神经元，49 hpf。n个= 10,n个=8，以及n个=6个神经元，54 hpf。在*g228秒*-α*2-通道*-表达神经元与*GFP公司*-在49或54 hpf表达神经元(第页= 0.869).C–E类极坐标图和雷达图显示了52 hpf转换前后神经元表达结构的丝足分布。C类,*GFP公司*-表达神经元；在49和54hpf时的分布是不同的(第页< 0.001).n个=173和n个分别为93丝足。D类,重量-α*2-通道*-表达神经元；在49和54 hpf时分布不同(第页= 0.037).n个=89和n个分别=70丝足。The filopodial distributions forGFP公司和重量-α*2-通道*-表达神经元在前后没有显著差异(第页=0.417和第页分别为0.445）。E类,*G228S型*-α*2-通道*-表达神经元；分布类似(第页= 0.985).n个=128和n个前后分别为89丝足。The filopodial distributions forG228S型-α*2-通道*-49hpf和54hpf的神经元表达与上述两种细胞无显著差异*GFP公司*或重量-α*2-通道*-49hpf时神经元的表达(第页=0.513和第页分别为0.718）。

**图5。**
吗啡啉微量注射后观察OMN表型。MO1注入的多光子侧视图(A类,D类,***G公司***,J型)或注入MO2(B类,E类,***H（H）***)在72hpf条件下对变形胚进行α-微管蛋白免疫染色。观察到的表型标记在左侧，包括异位分支(A类,B类)，被误导的分支(D类,E类)，OMN发育不全或分支缺失(***G公司***,***H（H）***)或整个OMN投影暂停(J型). 箭头表示异位神经分支；箭头表示发育不良或截短的神经投射*三叉神经的分支。OMN示意图(C类,F类,我,***L（左）***)如图1所示，误导性和异位分支显示为深绿色。K，从48 hpf变形胚中提取的总RNA的RT-PCR。对于wt和MO1显微注射胚胎，在外显子和内含子引物扩增后，检测到预剪接和成熟形式的mRNA。微量注射MO2后，只检测到预裂mRNA。***M（M）***,N个MO1注射胚胎的多光子侧视图和MO1错配控制α-微管蛋白和*我的HC*(***M（M）***)或α-微管蛋白和突触前小泡(N个)72 hpf。***M（M）***箭头表示多个神经分支长入IO肌肉。N个箭头表示突触染色。***O（运行）***，对照组“错配MO1”注射胚胎在72 hpf时进行α-微管蛋白免疫染色的多光子侧视图。黄色和红色箭头分别表示MR和IR肌肉的神经分支；蓝色箭头表示指向IO肌肉的神经分支；白色箭头表示SR肌肉的神经分支。***P–R（P–R）***，wt胚胎免疫染色对照图像***M–O型***.比例尺，50μm。

**图6。**
细胞骨架动力学和α2-chn。转染对照干扰shRNA的稳定（绿色）和不稳定（红色）微管蛋白的眼球运动生长锥染色(A类)或使用α2-chn shRNA(B类). 在这两种条件下，生长锥末端20μm处稳定微管面积与不稳定微管区域的比率(C类).n个=39和n个=71个神经元，分别用于控制和shRNA*第页= 0.004.

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