Chimeric virus-like particle vaccines displaying conserved enterovirus 71 epitopes elicit protective neutralizing antibodies in mice through divergent mechanisms

doi:10.1128/JVI.01848-13

.2014年1月；88(1):72-81.

doi:10.1128/JVI.01848-13。 Epub 2013年10月16日。

显示肠病毒71保守表位的嵌合类病毒颗粒疫苗通过不同机制诱导小鼠产生保护性中和抗体

叶晓华¹, 顾志强, 刘庆伟, 王晓丽, 石金平, 张云芳, 梁梁岗, 姚聪, 钟煌

附属机构

采购管理信息： 24131712
PMCID公司：项目经理3911748
内政部： 10.1128/JVI.01848-13

显示肠病毒71保守表位的嵌合类病毒颗粒疫苗通过不同机制诱导小鼠产生保护性中和抗体

叶晓华等。 J维罗尔. 2014年1月.

.2014年1月；88(1):72-81.

doi:10.1128/JVI.01848-13。 Epub 2013年10月16日。

作者

叶小华¹, 顾志强, 刘庆伟, 王晓丽, 石金平, 张云芳, 梁梁岗, 姚聪, 钟煌

附属

¹上海巴斯德研究所分子病毒学和免疫学重点实验室，中国科学院上海生物科学研究所，上海，中国。

采购管理信息： 24131712
PMCID公司：项目经理3911748
内政部： 10.1128/JVI.01848-13

摘要

肠道病毒71型（EV71）是手足口病的主要致病因子，经常发生在幼儿中。由于EV71中有11个亚基因型（A、B1至B5和C1至C5），因此需要一种能够保护所有这些亚基因型的EV71疫苗。我们报告了两种嵌合病毒样颗粒（VLPs）的疫苗潜力和保护机制，它们呈现EV71保守的中和表位。我们表明，乙型肝炎核心抗原（HBc）与EV71的SP55或SP70表位融合，分别命名为HBcSP55和HBcSP70，可以快速生成并自组装成VLP，表位显示在表面。嵌合VLP免疫诱导小鼠产生载体和表位特异性抗体反应。抗-HBcSP55和抗HBcSP70血清，而非抗-HBc血清，能够在体外中和EV71的多种基因型和菌株。重要的是，抗-HBcSP55或抗-HBc SP70血清的被动免疫可以保护新生小鼠免受致命的EV71感染。有趣的是，抗-HBcSP70血清可以抑制EV71与敏感细胞的粘附，而抗-HBc SP55血清则不能。然而，两种抗血清都能在附着后阶段中和体外EV71感染。抗SP70和抗SP55血清的中和和保护机制不同，部分归因于它们各自结合真实病毒颗粒的能力。总之，我们的研究不仅表明显示SP55和SP70表位的嵌合VLP有望成为广谱EV71疫苗的候选分子，而且还揭示了SP55和SP 70靶向抗体的独特中和机制。

PubMed免责声明

数字

图1
HBc融合蛋白在大肠杆菌中的表达。（A）本研究中使用的结构表达盒的示意图。大肠杆菌表达的HBc融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析。蛋白质样品经过SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯蓝（B）染色，或印在聚偏二氟乙烯膜上，用单克隆抗-HBc（C）或抗-His（D）抗体进行Western印迹。车道1，HBc；车道2；HBcSP55；3号车道，HBcSP70。

图2
嵌合VLP的组装。将纯化的蛋白质分层到10%到50%的蔗糖梯度上，并按照材料和方法中的描述进行离心。从上到下取十个组分进行分析。（A）使用HBc特异性单克隆抗体对HBc、HBcSP55和HBcSP70组进行Western blot分析。（B）用识别SP70表位的小鼠单克隆抗体D5对蔗糖梯度组分进行ELISA分析。数据是每个分数的三份样品的平均值。（C） HBc VLP的电子显微镜。（D） HBcSP55 VLP的电子显微镜。（E） HBcSP70 VLP的电子显微镜。条形，50 nm。

图3
嵌合VLP在小鼠中引发中和抗体反应。第0周、第2周和第4周，用PBS、HBc、HBcSP55或HBcSP70免疫6只小鼠。在第6周，收集每只小鼠的血清。用PBS将抗血清稀释为1:100，并用于ELISA，以确定HBc特异性抗体反应（A）、SP55特异性抗体响应（B）和SP70特异性抗体应答（C）。（D）从1:8开始连续稀释抗体，以确定针对EV71/G082的中和滴度。每个符号代表一个单独的鼠标，线条表示组的几何平均值。

图4
抗原特异性抗体反应动力学。第0周、第2周和第4周，用PBS、HBc、HBcSP55或HBcSP70免疫6只小鼠。在第二次和第三次给药后2周收集每只小鼠的血清，并通过ELISA分析以测量HBc特异性抗体反应（A）、SP55特异性抗体响应（B）和SP70特异性抗体应答（C）。所有血清均以1:100的稀释度进行测试。每个符号代表一个单独的鼠标，线条表示组的几何平均值。

图5
嵌合VLP免疫血清被动保护小鼠免受致命EV71攻击。（A和B）在一个实验中，1日龄小鼠组经腹腔注射100μl汇集的抗PBS、抗HBc、抗HBcSP55或抗HBcSP 70小鼠血清/小鼠，24小时后，经腹腔接种3.55×10⁶TCID公司₅₀EV71/MAV-VR。随后每天观察小鼠16天的存活率（a）和临床评分（B）。临床评分如下：0分，健康；1、流动性降低；2、肢体无力；3、瘫痪；第四，死亡。（C和D）在另一个实验中，6周龄的雌性BALB/C小鼠分别在第0、2和4周用PBS、HBc、HBcSP55或HBcSP70腹腔免疫。第三次免疫后，允许小鼠交配。免疫母鼠出生后24小时内出生的新生小鼠接受腹腔注射2.22×10⁶TCID公司₅₀EV71/MAV-VR。随后，如上所述，对受到攻击的小鼠进行为期17天的存活率（C）和临床评分（D）监测。

图6
VLP免疫血清对病毒附着的抑制作用。不同数量的VLP免疫血清与3.8×10孵育⁵TCID公司₅₀在37°C下，将EV71在200-μl最终体积中放置1小时。将混合物添加到RD细胞中，并在4°C下孵育1小时，以便病毒附着。孵化后，未结合的病毒被仔细清洗掉。然后提取处理细胞的总RNA，并使用qRT-PCR对细胞结合EV71的基因组拷贝进行相对定量，如材料和方法中所述。这个年axis显示了抗血清处理细胞与对照细胞（仅感染病毒的细胞）EV71基因组RNA相对水平的比率。显示了三个重复井的平均值（SEM）的平均值±标准误差。虚线表示分析的背景水平。这些数据是两个独立实验的代表性结果。统计显著性由学生确定t吨测试，如下所示：不适用。，*P（P）*> 0.05; *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; 或***，*P（P）*< 0.001.

图7
VLP免疫血清结合不同EV71颗粒的能力。将汇集的抗血清稀释为1:100，然后分别用EV71 E颗粒、F颗粒、VLP或重组VP1蛋白作为捕获抗原用于ELISA。平均值±OD的SEM₄₅₀显示了三口井的读数。这些数据是两个独立实验的代表性结果。

图8
肽ELISA表位定位。将抗-HBcSP55（A）和抗-HBc SP70（B）血清稀释为1:100，然后使用指示的合成肽作为捕获抗原用于ELISA。平均值±外径的扫描电镜₄₅₀显示了三个重复井的读数。这些数据是三个独立实验的代表性结果。显示了每个合成肽的氨基酸序列。与SP55或SP70表位相同的氨基酸以红色突出显示。

图9
用VLP免疫血清进行附着后中和。EV71（100 TCID₅₀)在4°C条件下，允许与RD电池连接1小时。清洗完无结合病毒后，将细胞与VLP免疫血清在不同稀释度下在37°C下培养1小时，如图所示。三次洗涤后，将处理过的细胞在37°C下培养72小时，然后观察CPE或进行MTT分析，以评估细胞活力，如材料和方法所述。（A）以1:8稀释度使用所示抗血清处理的细胞的代表性图像。（B） MTT法测定抗血清处理细胞的活性。数据为OD的平均值±SEM₄₉₀四个重复井的读数。虚线表示截止线，即外径的50%₄₉₀未感染细胞的读数。

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