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.2013年12月；33(24):4936-46.
doi:10.1128/MCB.00601-13。 Epub 2013年10月14日。

组蛋白H3K27三甲基化抑制SET1-like H3K4甲基转移酶复合物的H3结合和功能

金大焕 1, 沾云汤, 岛田美穗, 击败菲尔兹, 布赖恩·霍克·卢米斯, 玛雅巴达根, Seunghee Lee（李承熙）, 李秀京（Soo-Kyung Lee）, 汤姆·W·缪尔, 罗伯特·G·罗德, Jae W Lee（李在伟）
附属机构

组蛋白H3K27三甲基化抑制SET1-like H3K4甲基转移酶复合物的H3结合和功能

金大焕等。 分子细胞生物学. 2013年12月.

摘要

三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）和H3K27通常分别标记转录活性和抑制性染色质。在大多数细胞类型中，这两种修饰相互排斥，这种分离对基因表达的调节至关重要。然而，这种反相关是如何实现的还没有完全理解。在这里，我们表明去除H3K27三甲基标记可以通过诱导组蛋白H3和SET1样复合物的两个常见亚基WDR5和RBBP5之间的新的相互作用，促进SET1样H3K4甲基转移酶复合物向其靶基因的募集。与此结果一致，H3K27三甲基化破坏了H3与类SET1配合物的相互作用，并拮抗了它们对肽（H3残基1至36）、组蛋白八聚体和单核小体底物进行H3K4三甲基化的能力。总之，我们的研究表明组蛋白H3的H3K27三甲基化抑制了之前未被识别的H3和类SET1复合物之间的相互作用。这提供了一个重要的机制，指导H3K4和H3K27三甲基化之间的反相关。

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数字

图1
图1
组蛋白H3包含WDR5和RBBP5的双重交互界面。（A和B）GST下拉分析，带有指示的GST融合和在体外翻译的Flag-tagged WDR5、Flag-RBBP5或纯化的ASCOM复合物与Flag-PA1。用抗Flag抗体免疫印迹法检测WDR5、RBBP5和ASCOM。GST融合的考马斯蓝染色显示为负荷控制。（C） 使用指定的H3肽和以下任一肽进行固定肽下拉分析在体外翻译后的标志-WDR5或标志-RBBP5。用抗Flag抗体免疫印迹法检测WDR5和RBBP5。所有输入均为5%。K4-me2，K4-二甲基H3。
图2
图2
H3K27三甲基化损害H3和WDR5/RBBP5的相互作用。（A、B、E和F）GST下拉分析，GST融合到指定的H3片段在体外翻译的Flag-PA1、Flag-ASH2L、Flag-WDR5、Flag-VDR5/S91F或Flag-RBBP5或带有Flag-taged PA1的纯化ASCOM复合物。用抗Flag抗体免疫印迹法检测PA1、ASH2L、WDR5、RBBP5和ASCOM。GST融合的考马斯蓝染色显示为负荷控制。（C） 使用指定的H3肽或在体外翻译的Flag-WDR5或Flag-RBBP5，或带有纯化ASCOM（通过Flag-PA1或RBBP5）或纯化的SET1复合物（通过Flage-CFP1或RBBP）。用抗Flag或RBBP5抗体通过免疫印迹法检测WDR5、RBBP5、PA1和CFP1。H3肽的考马斯蓝染色显示为负载对照。（D） ASCOM与含有未修饰或K27三甲基化H3的固定化重组单核小体的结合测定（通过抗WDR5和抗RBBP5免疫印迹监测）。单核小体中八聚体的考马斯蓝染色显示为负荷控制。SET1复合物也获得了类似的结果（数据未显示）。面板D中的输入为10%，所有其他输入为5%。wt，野生型。
图3
图3
H3K27三甲基化减弱H3K4三甲基化。（A到C）人SET1复合物和MLL1复合物（MLL1-com）依赖的H3K4甲基化被H3K27三甲基化抑制在体外显示了使用人类SET1/MLL1复合物对H3（1-20）和H3（1-36）肽进行H3K4甲基化分析，在K4或K27处进行或不进行指示的三甲基修饰。（D） H3（1–36）肽与人类SET1复合物孵育后H3K4甲基化状态的免疫印迹分析。人类SET1复合物（E和F）或ASCOM（G）对未修饰和H3K27三甲基化组蛋白八聚体（E和G）和单核小体（F）的（E到G）H3K4甲基化。H3K4me1，H3在K4处单甲基化；α、 反。
图4
图4
UTX的催化活性是RA诱导的反式激活所必需的。RA-依赖性转录的qRT-PCR分析第21页（A） ，随机存取存储器-β2（B） ，PDCD4（PDCD4）（C） ，IGFBP2型（D） 、和基站2（E） 在HEK293细胞中转染干扰siRNA（NC）或抗UTX siRNA（si-UTX）和野生型（UTX-wt）或无催化活性（UTX-m）形式的si-UTX-resistant UTX.*，P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001.
图5
图5
用HEK293细胞进行MTT分析。用增加的RA量处理细胞40小时后，细胞增殖减少，但通过si-UTX敲除UTX干扰了RA的这种抗增殖作用，P（P）< 0.05.
图6
图6
RA-诱导的反式激活需要去除H3K27三甲基化。（A） 使用转染有干扰siRNA（NC）或si-UTX的HEK293细胞与指示抗体进行协同免疫沉淀分析。（B至D）ChIP显示转录起始位点（+1）的H3K27三甲基化（B）、H3K4三甲基化（C）和RBBP5占有率（D）水平以及第21页用干扰siRNA（NC）或si-UTX转染HEK293细胞。（E） 使用用si-UTX和野生型（UTX-wt）或无催化活性（UTX-m）形式的si-UTX抗性UTX转染的HEK293/Flag-PA1细胞，用所指示的抗体进行免疫共沉淀测定。（F） ChIP显示RBBP5的RA依赖性募集到第21页在用si-UTX转染的HEK293细胞中，野生型UTX（UTX-wt）形式比无催化活性（UTX-m）形式的si-UTX抗性UTX更容易恢复。相反，这两种形式的UTX很容易被招募到第21页.WB，蛋白质印迹。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01.
图7
图7
UTX还需要用于其他RAR靶基因的H3K27me3抑制状态和H3K4me3激活状态之间的转换，随机存取存储器-β2（A至D）和PDCD4（PDCD4）（E到H）。使用转染干扰siRNA（NC）或si-UTX的HEK293/Flag-PA1细胞，对H3K27（A和E）和H3K4三甲基化（B和F）水平以及RBBP5占用率（C和G）进行ChIP分析。（D和H）ChIP分析显示RBBP5占用水平随机存取存储器-β2（D） 和PDCD4（PDCD4）（H） 在转染si-UTX和野生型（UTX-wt）或无催化活性（UTX-m）形式的si-UTX-resistant UTX.*的HEK293细胞中，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.
图8
图8
H3K27三甲基标记的去除先于H3K4三甲基化。（A） ChIP显示UTX以及ASCOM-MLL3/MLL4的其他亚单位依赖RA-招募到随机存取存储器-β2稳定表达标记PA1的HEK293细胞中的启动子（HEK293/Flag-PA1细胞）。（B至H）ChIP显示转录起始位点（+1）和RARE区域ASC-2（B）、RBBP5（C）、MLL4（D）、MLL 3（E）和UTX（F）以及H3K27三甲基化（G）和H3K4三甲基化水平的招募第21页RA处理0、0.5、1、2和4小时后，在HEK293细胞中*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.
图9
图9
H3K4和H3K27三甲基化之间相互作用的模型。WDR5/RBBP5亚复合物与R2或R26结合，R26结合被相邻K27的甲基化抑制。R2和R26是被WDR5和RBBP5选择性识别还是随机识别，还有待确定。目前还不清楚WDR5/RBBP5复合物是在同一个H3尾部还是在两个不同的H3尾部识别R2和R26。H3K4三甲基化是否发生在顺式（即在通过H3R26与WDR5/RBBP5相互作用的同一组蛋白H3分子上）或反式（另一个H3分子缺乏WDR5/RBBP5与H3R26的相互作用）。SET1样复合物的招募通过SET1样复合体的特定亚单位与其靶转录因子之间的相互作用发生（步骤i）。对于ASCOM-MLL3/MLL4，这提供UTX并导致H3K27三甲基标记的去除，而JMJD3或未识别的H3K17脱甲基酶可能对其他类SET1复合物起作用（步骤ii）。H3K27三甲基标记的缺失允许H3K4三甲基化，这进一步稳定了SET1样复合物与其靶基因之间的相互作用，并且还可以提供一种通过激活基因的相邻区域传播SET1样复合物和H3K4甲基化的手段（步骤iii）。
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