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.2014年2月1日;23(3):668-81.
doi:10.1093/hmg/ddt454。 Epub 2013年9月18日。

鞘内注射rAAV广泛的脊髓转导为肌萎缩侧索硬化症提供有效的RNAi治疗

附属公司

鞘内注射rAAV广泛的脊髓转导为肌萎缩侧索硬化症提供有效的RNAi治疗

王红艳等。 人类分子遗传学. .

摘要

肌萎缩侧索硬化症(ALS)会导致运动神经元变性和瘫痪。任何治疗都不能显著减缓或阻止疾病的进展。SOD1基因突变通过增加毒性导致家族性ALS的一个子集。原则上,这些病例可以通过RNAi来治疗,RNAi可以破坏突变的mRNA,从而消除有毒蛋白质。然而,没有系统可以有效地提供RNAi治疗。重组腺相关病毒(rAAV)因其持久的基因表达和低毒性而成为一种很有前景的载体。然而,ALS会影响中枢神经系统(CNS)的广泛区域。缺乏广泛传播rAAV的实际手段阻碍了其在ALS治疗中的应用。为了克服这一障碍,我们将几种rAAV血清型注射到脑脊液中。我们发现,一些rAAV血清型,如rAAVrh10和rAAV9,在鞘内单次注射后,在脊髓全长和第三脑室单次注射之后,在宽阔的前脑转导细胞。此外,在一只非人灵长类动物中,鞘内注射rAAVrh10可以在整个脊髓中有力地转导运动神经元。这些结果表明该载体对ALS具有治疗潜力。为了验证这一点,我们将表达以SOD1为靶点的人工miRNA的rAAVrh10载体注射到SOD1G93A小鼠中。这种治疗降低了突变SOD1的表达,减缓了疾病的进展。我们的结果证明了rAAV在提供基因治疗以治疗ALS和其他影响CNS广泛区域的疾病方面的潜力。

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数字

图1。
图1。
将rAAVrh10和rAAV9与1、2和8型AAV血清进行单次鞘内注射到腰椎CSF后,rAAVr10和rAA V9的广泛转导。(A类)全山大脑和脊髓中的GFP荧光。rAAV(4.8×1010vg)注入每只小鼠。在注射后28天,解剖出整个大脑和脊髓。GFP荧光是直接从整个组织上拍摄的。右侧第三列中的面板是第二个面板的假彩色热图,显示了不同区域的GFP强度。热图是通过拍摄8位单色图像并在NIS-elements软件(尼康)上应用“热图”调色板生成的。每种颜色代表不同的荧光强度:粉红色对应最大强度255,紫色对应最小强度1。(B类)注射AAVrh10的小鼠脑干和脊髓纵切面的GFP荧光。从左至右:脑干(BS)、颈椎(CSC)、胸椎(TSC)和腰椎脊髓(LSC)节段。比例尺代表250µm。(C类)a组显示了颈脊髓的一个扩大段,它代表了脊髓的各个层面。白色箭头指向众多星形胶质细胞中的运动神经元(红色箭头)。比例尺=20µm。图b显示了星形胶质细胞形态细胞的放大图。比例尺=5µm。面板c显示了具有运动神经元形态的细胞的放大视图。比例尺=10µm。在本图和其他图中的所有图像中,GFP荧光是直接从未染色的切片中捕获的。
图2。
图2。
单次注射4.8×10后前脑细胞的广泛而稳健的转导10rAAV9和rAAVrh10颗粒进入第三脑室。(A类)转导效率的比较表明,rAAV9和AAVrh10是最佳血清型。注射后28天,拍摄整个坐骑大脑中的GFP荧光。右侧第三列中的面板是第二个面板的假彩色热图,显示大脑中的GFP强度,如图1图例所示。(B类)rAAV9注射小鼠的CNS冠状切片。剖面平面标记在底部明亮的区域图像中。OB,嗅球;FB,前脑;CB,小脑;BS,脑干;CSC、TSC、LSC和SSC分别代表颈、胸、腰和骶部脊髓。
图3。
图3。
rAAVrh10-GFP经鞘内注射入脑脊液后,可转导神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,但不转导小胶质细胞。对脊髓切片进行神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)、少突胶质细胞(APC)和小胶质细胞(Iba-1)染色。第一行的比例尺为10µm,第二和第三行为5µm和第四行为20µm。
图4。
图4。
在绒猴的腰椎脑脊液中鞘内注射rAAVrh10-GFP,可使沿脊髓全长的运动神经元中的GFP强烈表达,这一点可通过免疫染色观察到(A类)子宫颈(B类)胸部和(C类)腰椎脊髓。比例尺=200µm。(D–F型)(A)–(C)中腹角运动神经元(红框)的放大图。比例尺为(D)和(F)中的100µm和(E)中的50µm。(G公司–I)(A)-(C)中腹侧白质(蓝盒)运动轴突中GFP的表达。比例尺=100µm。(J–左)GFP分别在(A)–(C)的背根轴突(黄色方框)中表达。比例尺=50μm。(M(M)–O型)背索(紫色方框)分别位于(A)–(C)中。比例尺=100微米(m和O)和50微米(N)。请注意,在颈(M)和胸(N)脊髓的楔形束(cu)中有较强的GFP信号,但在腰(O)脊髓的薄束(gr)中只有适度的GFP信息。GM是指灰质。(P(P)–R)(A)–(C)中灰质的中间区域(绿色方框)。刻度条(J)至R(右)=50µm。所有切片均用苏木精进行复染。
图5。
图5。
体外amiR-SOD1结构体对SOD1敲除的测试。(A类)该结构的示意图,使用鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子来驱动GFP和amiR-Sod1表达的转录。pA=聚A信号。(B类)使用Northern印迹测试不同amiR-SOD1的SOD1敲除活性。用质粒构建物转染人HEK293细胞。总RNA用于SOD1 mRNA的Northern印迹(C类)转染HEK293细胞SOD1蛋白的Western blot检测。请注意,amiR-SOD1#1、2、3、5、6和8显著地击倒了SOD1,而amiR-SOD1#4、7和9的击倒活性较差。(D类)通过转染HEK293细胞测试AAVrh10-amiR-SOD1#5。SOD1通过从转导48小时的细胞中提取的总蛋白进行western blot检测。Scr代表AAVrh10-amiR-Scr,其表达扰乱的miRNA。M代表模拟转染。β-肌动蛋白被用作所有斑点的负荷控制。
图6。
图6。
AAVrh10-GFP-amiR-SOD1表达amiR-SOD1并下调SOD1的表达体内. (A类)来自高水平和低水平转导(td)的小鼠脊髓的amiR-SOD1的实时PCR。将这些水平与注射PBS的小鼠假转导脊髓进行比较(B类)利用高、低和假载体转导对脊髓SOD1 mRNA进行Northern印迹。(C类)注射amiR-Scr或amiR-SOD1的单个动物脊髓SOD1蛋白印迹。微管蛋白和肌动蛋白被检测为负荷对照。印迹板下方的数字是相对SOD1带密度归一化为微管蛋白带密度,然后是未注射小鼠的平均SOD1密度,设定为100。注意四只注射了AAV-amiR-SOD1的动物的不同程度的击倒。(D类)注射AAVrh10-GFP-miR-SOD1的小鼠脊髓切片的免疫荧光染色。神经元用NeuN标记,星形胶质细胞用GFAP标记,少突胶质细胞用APC标记。顶部、中部和下部面板中的比例尺分别为10、5和10µm。请注意,与GFP阴性细胞(箭头)相比,GFP阳性细胞(箭头所示)hSOD1染色较弱。
图7。
图7。
AAVrh10-GFP-amiR-SOD1的治疗益处。雌性SOD1G93A小鼠在55至60日龄期间鞘内注射amiR-SOD1(红色曲线)和amiR-Scr载体(绿色曲线),并随后每周测量体重。(A类)由体重监测的疾病进展,在两组中同时达到峰值(箭头所示)。然而,与amiR-Scr治疗组相比,amiR-SOD1治疗组的下降速度较慢。(B类)疾病发作定义为峰值体重的一天,两组之间没有显著差异(另见表1)。(C类)amiR-SOD1治疗组的早期疾病阶段(定义为峰值体重减轻10%)延迟(另见表1)。(D类)amiR-SOD1治疗组的终末期(定义为四肢瘫痪的开始)明显延迟(另见表1)。(E类)AAVrh10-GFP-amiR-SOD1注射小鼠的寿命与转导水平相关。(F类)AAVrh10-GFP-amiR-Scr注射小鼠的寿命与转导水平之间没有相关性。

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