Siramesine triggers cell death through destabilisation of mitochondria, but not lysosomes

doi:10.1038/cddis.2013.361

.2013年10月3日；4（10）：e818。

doi:10.1038/cddis.2013.361。

西拉米辛通过线粒体的不稳定而非溶酶体触发细胞死亡

哈夫纳·采森¹, U雷普尼克, V土耳其语, B土耳其语

附属公司

附属

¹1] 斯洛文尼亚卢布尔雅那1000号贾莫瓦39号乔伊夫·斯特凡研究所生物化学、分子和结构生物学系[2]斯洛文尼亚卢布尔雅纳1000号贾莫瓦39号乔伊夫·斯蒂芬国际研究生院。

PMID： 24091661
预防性维修识别码：项目经理3824671
内政部： 10.1038/cddis.2013.361

西拉米辛通过线粒体的不稳定而非溶酶体触发细胞死亡

哈夫纳·采森等。细胞死亡病. 2013.

.2013年10月3日；4（10）：e818。

doi:10.1038/cddis.2013.361。

作者

哈夫纳·采森¹, U雷普尼克, V土耳其语, B土耳其语

附属

¹1] 斯洛文尼亚卢布尔雅那1000号贾莫瓦39号乔伊夫·斯特凡研究所生物化学、分子和结构生物学系[2]斯洛文尼亚卢布尔雅纳1000号贾莫瓦39号乔伊夫·斯蒂芬国际研究生院。

PMID： 24091661
预防性维修识别码：项目经理3824671
内政部： 10.1038/cddis.2013.361

摘要

一种sirama-2受体激动剂西拉米辛已被证明能触发癌细胞的细胞死亡，并在体内表现出强大的抗癌活性。然而，对其作用机制仍知之甚少。我们发现，在20μM以上的浓度下，西拉米辛可以在许多细胞系中诱导细胞快速死亡。在HaCaT细胞中，细胞死亡伴随着caspase激活、线粒体膜电位（MMP）快速丧失、细胞色素c释放、心磷脂过氧化和典型的凋亡形态，而在U-87MG细胞中，尽管MMP迅速丢失，但大多数凋亡标志并不显著。与MMP在20μM以上西拉氨酸的快速损失相比，在所有测试浓度（5-40μM）下，溶酶体pH值均快速增加；然而，它并不伴随溶酶体膜渗透（LMP）和溶酶体酶释放到胞浆中。溶酶体pH值的增加降低了溶酶体降解的潜力，如未成熟形式半胱氨酸组织蛋白酶的积累所示。亲脂性抗氧化剂α-生育酚（而非亲水性抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸）可显著减少细胞死亡和线粒体膜的不稳定，但不能阻止溶酶体pH值的增加。当浓度低于15μM时，西拉米辛在2天后或更晚时触发细胞死亡，这似乎与一般的代谢和能量失衡有关，这是由于内吞途径、细胞内运输和能量生产的缺陷造成的，而不是由特定的分子事件造成的。总的来说，我们发现西拉米辛处理的细胞中的细胞死亡是由线粒体的不稳定引起的，并且与LMP和组织蛋白酶释放到胞浆中无关。此外，西拉米辛不太可能只通过sigma-2受体发挥作用，而是通过细胞内的多个分子靶点发挥作用。因此，我们的研究结果对设计具有高抗癌潜力的下一代西拉氨酸类似物具有重要意义。

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数字

图1
西拉米辛对不同细胞系活力的影响。细胞与浓度增加的西拉米辛（0–45 μM）适用于8–48 h.胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（20 μM）组织蛋白酶抑制剂E-64d（10 μM）和亲脂抗氧化剂α-生育酚（0.3 mM）应用2 治疗前h。用西拉米辛孵育后，用膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色，然后进行流式细胞仪分析。活细胞被定义为膜联蛋白V/PI双阴性细胞。实验重复进行；条形代表平均值±S。D(一)西拉米辛对8周后不同细胞系活力的影响用西拉氨酸孵育h。(b条)较低的西拉氨酸浓度对HaCaT细胞后期存活率的影响（12–48 h） ●●●●。S、西拉米辛；T、，α-生育酚

图2
西拉明激活HaCaT和U-87MG细胞中的半胱天冬酶。用不同浓度的西拉氨酸处理细胞，然后在指定的时间点收集总细胞裂解物。使用Ac-DEVD-AFC（10 μM）基于底物水解的初始速度。实验一式三份；条形代表平均值±S。D(一)HaCaT细胞的DEVD-ase活性与时间和西拉氨酸浓度的关系。(b条)HaCaT和U-87MG细胞与西拉米辛孵育4和6小时后的DEVD-ase活性及其预防α-生育酚。(**c（c）**)LLOMe对HaCaT和U-87MG细胞DEVD-ase活性的影响小时(d日)西拉米辛处理的HaCaT和U-87MG细胞的超微结构。处理后，细胞用1%戊二醛固定并包埋在epon中。用TEM分析薄片。棒材尺寸，5 μm.A，凋亡细胞；S、西拉美辛；T、，α-生育酚

图3
西拉米辛对线粒体的影响(一)西拉明对线粒体跨膜电位的影响。在指定的时间段内，用不同浓度的西拉明处理HaCaT和U-87MG细胞。胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（20 μM）组织蛋白酶抑制剂E-64d（10 μM）和亲脂抗氧化剂α-生育酚（0.3 mM）应用2 治疗前h。西拉米辛处理后，所有样品立即用最终浓度为3.5的JC-1染色 μg/ml，并用流式细胞仪进行分析。红细胞被认为是线粒体完整的细胞。实验重复进行；条形代表平均值±S。D(b条和**c（c）**)西拉米辛和α-生育酚对cyt释放的影响*c（c）*进入细胞溶质。在西拉明治疗后，在指定的时间点收集细胞溶质裂解物，然后进行SDS-PAGE、western blotting和cyt免疫检测*c（c）*.Z，Z-VAD-FMK；E、 E-64d；T、，α-生育酚；S、西拉米辛；细胞周期*c（c）*，细胞色素*c（c）*

图4
西拉米辛诱导的细胞死亡中ROS的生成。用不同浓度的西拉明处理HaCaT细胞。抗氧化剂α-生育酚（0.3 mM）和NAC（8 mM）应用2 治疗前h。西拉米辛处理后，羧基-H₂立即将DCFDA添加到所有样品中，并用流式细胞仪进行分析。羧基-H的几何平均值₂显示每个样品的DCFDA荧光强度。实验分两次进行；条形代表平均值±S。D(一)15后的直方图 40分钟孵育 μ存在或不存在M西拉明α-生育酚。实线表示西拉米辛处理的细胞；虚线表示控制单元。(b条)ROS生成15 用不同浓度的西拉氨酸处理后min。(**c（c）**)ROS第2代 h和8 用低浓度的西拉米辛（10 μM） ●●●●。(d日)NAC对存活率和MMP的影响。S、西拉米辛；T、，α-生育酚

图5
西拉米辛处理的HaCaT和U-87MG细胞的透射电镜超微结构。处理后，细胞用1%戊二醛固定并包埋在epon中。用TEM分析薄片。利用体视学定量分析薄片上U-87MG细胞中高尔基池的存在。条形图显示高尔基体池膜总长度（通过交叉计数估算）与细胞质总面积（通过点计数估算）之间的比值。钢筋尺寸，1 μm.V，带有细胞质内含物的液泡；G、高尔基池和小泡区；S、西拉米辛；T、，α-生育酚

图6
西拉米辛对溶酶体的影响。(一)西拉米辛处理后溶酶体积累LysoTracker Green的能力。HaCaT和U-87MG细胞用不同浓度的西拉米辛处理并培养指定的时间。胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（20 μM）组织蛋白酶抑制剂E-64d（10 μM）和亲脂性抗氧化剂α-生育酚（0.3 mM）施用2 治疗前h。在与西拉氨酸孵育后，所有细胞立即用最终浓度为40的LysoTracker Green染色 nM，并用流式细胞仪进行分析。显示每个样品的LysoTracker绿色荧光强度的几何平均值。实验重复进行；条形代表平均值±S。D(b条)基于Z-FR-AMC底物水解的西拉米辛处理后细胞溶质和总半胱氨酸组织蛋白酶活性的荧光检测。用不同浓度的西拉氨酸处理生长在96周板中的HaCaT和U-87MG细胞。与西拉氨酸孵育后，15或200 μ将g/ml洋地黄素直接添加到微孔中，以分别溶解质膜（细胞溶质活性）或所有细胞膜（总活性）。12之后在冰上与洋地黄素孵育min后，用Z-FR-AMC荧光法测定半胱氨酸组织蛋白酶活性，并计算反应的初始速度。实验一式三份；条形代表平均值±S。D(**c（c）**)HaCaT细胞1胞浆和总提取物中组织蛋白酶L的免疫印迹和免疫检测西拉米辛处理后h。用15或30和200制备细胞溶胶和总提取物 μ分别为g/ml洋地黄素。装载等量的样品，蛋白质在12.5%SDS-PAGE中溶解，转移到硝化纤维素膜上，并使用特定抗体进行标记。Z、 Z-VAD-FMK；E、 E-64d；T、，α-生育酚；S、西拉米辛；D、洋地黄素；CYT，细胞溶质；TOT，总计

图7
西拉米辛在蛋白质水平上诱导组织蛋白酶L和LC3的变化。(一)用不同浓度的西拉明处理HaCaT细胞，并在指定的时间点在RIPA缓冲液中制备细胞总提取物。蛋白质在12.5%SDS-PAGE中溶解并转移到硝化纤维素膜上。用特异性抗体标记组织蛋白酶L和LC3。(b条)LC3（绿色）和LAMP-2标记的不同浓度西拉米辛处理HaCaT细胞的免疫细胞化学抗体（红色）。S、西拉米辛

图8
西拉美辛介导的对细胞内过程影响的示意图。所有西拉氨酸浓度都会迅速增加溶酶体pH值，并导致细胞内转运缺陷。仅高浓度（高于20 μM）触发基质金属蛋白酶的突然丢失，导致早期细胞死亡，根据细胞系的不同，早期细胞死亡可以是凋亡性的或非凋亡性的

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[1] Martin WR、Eades CG、Thompson JA、Huppler RE、Gilbert PE。吗啡类药物对非依赖性和吗啡依赖性慢性脊髓犬的影响。药理学实验与治疗杂志。1976;197:517–532.-公共医学

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[7] Colabufo NA、Berardi F、Contino M、Niso M、Abate C、Perrone R等。一些sigma2激动剂和sigma1拮抗剂在肿瘤细胞系中的抗增殖和细胞毒性作用。Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。2004;370:106–113.-公共医学

[8] Colabufo NA、Berardi F、Contino M、Niso M、Abate C、Perrone R等。一些sigma2激动剂和sigma1拮抗剂在肿瘤细胞系中的抗增殖和细胞毒性作用。Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。2004;370:106–113.-公共医学

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