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.2013年9月25日；33(39):15603-17.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3004-12.2013。

硫酸软骨素蛋白多糖能有效抑制侵袭，是脑肿瘤微环境的中心组织者

丹尼尔·西尔弗 1, Florian A Siebzehnrubl公司, 米歇拉·席尔茨, 安东尼·亚奇尼斯（Anthony T Yachnis）, 乔治·史密斯, 艾米·史密斯, 比约恩·谢夫勒, 布伦特·A·雷诺兹, 西尔弗, 丹尼斯·A·斯坦德勒
附属公司

硫酸软骨素蛋白多糖能有效抑制侵袭，是脑肿瘤微环境的中心组织者

丹尼尔·西尔弗等。 神经科学. .

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）仍然是所有脑部恶性肿瘤中最普遍、最致命的。导致这种不良预后的一个因素是肿瘤的高度侵袭性。GBM的特征是肿瘤细胞在显微镜下浸润整个大脑，而非神经转移瘤以及选择性低度胶质瘤则发展为独立且清晰的病灶。通过啮齿动物异种移植瘤模型和病理人类患者标本，我们提供了证据表明，这两种不同病理学之间的一个基本转换——侵袭和非侵袭——是通过肿瘤细胞外基质介导的。具体来说，非侵袭性病变与含有大量糖基化硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）的丰富基质有关，而糖基化CSPG在弥漫性浸润性肿瘤中基本上不存在。CSPG作为肿瘤微环境的中心组织者，极大地影响了常驻反应性星形胶质细胞，诱导其从肿瘤块中大量流出，并由此包裹非侵袭性病变。此外，CSPG诱导肿瘤相关小胶质细胞的激活。我们证明星形胶质细胞包膜可以直接抑制肿瘤的侵袭，并且它在GBM中的缺失提供了一个有利于扩散浸润的环境。我们还鉴定了白细胞共同抗原相关磷酸酶受体（PTPRF）作为细胞外糖基化CSPG和非侵袭性肿瘤细胞之间的假定中介。总之，我们认为CSPG是脑肿瘤组织病理学的关键调节因子，有助于阐明肿瘤微环境在脑肿瘤侵袭中的作用。

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数字

图1。
图1。
不同的人脑胶质瘤细胞系的移植导致了差异侵袭。A类，一系列初级人类GBM(小时GBM）细胞系对高级别胶质瘤的弥漫侵袭性病理表现优于(B类)常规异种移植模型U-87MG或原发性人类II级星形细胞瘤，小时胶质瘤II级L7。C–E类，可以很容易地在每个初级阶段观察到微观渗透小时GBM细胞系(F–G公司)与植入的U-87MG和小时胶质瘤II级L7。H–M，根据植入动物的肿瘤切片制备的阈值图像量化肿瘤的整体侵袭性，并强调侵袭性和非侵袭性肿瘤表型之间的显著差异（平均值±SEM、单向方差分析、Bonferroni-Dunn事后（post-hoc）测试***第页与U-87MG和小时胶质瘤II级L7，n个=6/组）。
图2。
图2。
CSPG糖基化区分非侵袭性和侵袭性胶质瘤。A–B〃CS-GAG在非侵袭性、严格扩张性病变的ECM中大量存在(C–E〃)而弥漫性侵袭小时GBM异种移植物生长在缺乏糖基化CSPG的环境中。F类CS-GAG-结合WFA-凝集素的荧光强度定量显示侵袭性和非侵袭性胶质瘤之间CS-糖基化的差异体内（a.u.，任意单位；平均值±SEM，未配对t吨测试*第页< 0.0001,n个=18/组）。G公司，对培养的胶质瘤细胞或全肿瘤蛋白裂解物中的Ch'ase ABC消化条件培养基进行点对点分析，通过揭示CS-GAG新靶点2-B-6、C-4-S和C-6-S来确认CSPG的存在。此外，在侵袭性肿瘤中观察到标称数量的糖基化CSPG和CS-neo-epitopes，与幼稚的啮齿动物大脑中的情况相同。H（H），总结两种非侵袭性（U-87MG和小时胶质瘤II级L7）和三种侵袭性(小时GBM L0、L1和L19）脑肿瘤类型阐明了浸润性和非浸润性胶质瘤之间CSPG糖基化的差异。I–P公司，总结数据的代表性免疫显微照片H（H）.比例尺，50μm。
图3。
图3。
反应性星形胶质细胞从CS-GAG丰富的非侵袭性病变所占据的空间中退出，但在侵袭性肿瘤细胞所占据的区域中持续存在。代表(A类)低-和(B类)高倍荧光显微照片显示了非侵袭性CS-GAG感病变的星形胶质细胞包裹。B′注意GFAP不足+过程保持在非侵入性物质的外部极限。C类–D′相比之下，侵袭性病变的荧光显微照片证明了反应性星形胶质细胞的广泛存在。E类斑点颗粒分析产生高度集中的CS-GAG含量区域（虚线右侧区域），类似于非侵袭性病变的CS-GGA含量丰富的ECM，并允许我们说明反应性星形胶质细胞对CSPG的强烈厌恶。F类在低浓度的CS-GAGs下，该斑点为星形胶质细胞的生长提供了一个允许的基质。G公司然而，随着CS-GAG浓度的增加，斑点区域变得越来越抑制生长，导致星形胶质细胞包裹斑点-请注意虚线右侧区域没有星形胶质细胞。H（H），用Ch’ase ABC处理其他有效的抑制点证实，CSPG的生长抑制特性特别来自其共价连接的CS-GAG。我，斑点梯度分析的定量强调了高水平CS GAG对反应性星形胶质细胞的抑制作用（平均值±SEM，单因素方差分析，Tukey’s事后（post-hoc）测试*第页<0.0001与0相比，n个=12点/条件）。比例尺，50μm。
图4。
图4。
侵袭性和非侵袭性脑损伤的小胶质细胞激活状态明显不同。典型的低倍荧光显微照片显示，小胶质细胞均匀分布于两者(A类)侵入性和(D类)非侵入性病变。B类、精细的分支形态和(C类)侵袭性肿瘤相关小胶质细胞具有弱的ED-1免疫反应性。相比之下，局限于富含CSPG的非侵袭性病变内的小胶质细胞显示(E类)变形虫形态和(F类)强烈的ED-1免疫反应表明激活状态和慢性炎症加剧。G公司，插图，体外在缺乏底物结合的CSPG的情况下，小胶质细胞保持分支形态，这表明在侵袭性肿瘤相关小胶质细胞中观察到的活化状态相对降低。H（H）相比之下，暴露于CSPG浓度增加的小胶质细胞与活化的变形虫形态相匹配，表明非侵袭性肿瘤中的活化增强。我小胶质细胞形态的定量分析表明，CSPG可以作为小胶质细胞的有效激活剂（平均值±SEM，双向方差分析，Bonferroni-Dunn事后（post-hoc）测试*第页<0.0001，与0相比#第页与0相比<0.0001，n个=30/组）。比例尺：A–F，50微米；G公司,H（H），10微米。
图5。
图5。
减少CS-GAG介导的抑制促进脑肿瘤侵袭。A类，肿瘤细胞扩散分析表明，U-87MG聚集是通过修饰蛋白多糖核心蛋白的有效抑制性CS侧链介导的。B类以剂量依赖性的方式，向培养基中添加Ch’ase ABC，但不添加阴性对照酶青霉素酶，以防止聚集，并促进维持细胞的均匀单层。C类，肿瘤细胞扩散分析的量化强调了Ch'ase ABC对聚集扩散的影响（平均值±SEM、单向方差分析、纽曼-凯尔斯事后（post-hoc）测试*第页< 0.05,n个=3/组）。D类,体内，而e（电子）表达GFP的阴性对照细胞呈现典型的U-87MG无创性病理学(E类)诱导的Ch’ase ABC表达可以使这些以前非侵袭性肿瘤细胞扩散浸润。F类，2B6抗体免疫染色证实U-87MG浸润发生在消化CS-GAG的区域内。G公司，定量Ch'ase ABC介导的侵袭阐明了CS-GAGs对肿瘤侵袭的抑制作用。（a.u.，任意单位；平均值±SEM，未配对t吨测试*第页< 0.05,n个=7（低压）-e（电子）绿色荧光蛋白；n个=15（对于LV-Ch’ase ABC）。比例尺，10μm。
图6。
图6。
CSPG受体LAR区分侵袭性病变和非侵袭性病变。代表性的荧光显微照片(A类)非侵入性和(B类)侵袭性病变突出了CS GAG结合、LAR磷酸酶受体表达的差异。C类LAR在整个非侵袭性肿瘤中均匀表达(D类)弥漫性侵袭性病变中完全没有(n个=6/组）。比例尺，50μm。E类Western分析证实了侵袭性和非侵袭性肿瘤之间LAR表达的二分法。
图7。
图7。
侵袭性和非侵袭性肿瘤的联合移植将侵袭性肿瘤隔离在非侵袭性肿块的边界内。A类，共移植无创U-87MG的代表性荧光显微照片-e（电子）GFP（绿色）有侵袭性小时GBM L19标准-如果Luc（红色）表示封装星形胶质细胞介导的入侵抑制。侵袭性肿瘤细胞（红色）在较大的非侵袭性肿块内组织成集体卷须，靠近病变边缘（星号），并平行于(B类)包裹病变的星形胶质细胞纤维密集网络(n个= 9). 可以模拟侵袭性和非侵袭性肿瘤/星形胶质细胞的相互作用在体外通过控制斑点分析的底物和电镀条件。C类与侵袭性肿瘤表型类似，CS-GAG的缺失允许肿瘤细胞在已建立的星形胶质细胞群体中自我隐匿。D类相反，含有丰富CS-GAG的斑点产生抑制性星形胶质细胞屏障，能够偏转并包含其他侵袭性物质小时GBM L1细胞(n个=每组8个盖玻片×每个盖玻片4个斑点）。E类，侵袭性和非侵袭性表型斑点分析的量化强调了高模式反应性星形胶质细胞可实现的显著侵袭抑制（平均值±SEM，未配对t吨测试***第页< 0.0001). 比例尺，50μm。
图8。
图8。
人类临床标本概括了丰富的CS-GAG与弥漫性侵袭之间的反向关系。A类，检查的5个PXA（II级星形细胞瘤）标本中有2个呈离散性病变，边界清晰，而(B类)5例中有4例表现出较强的CS-GAGs表达。C类，在5个PXA标本中的2个标本中观察到星形胶质细胞包裹，肿瘤的外边缘很明显。D类相比之下，5个高浸润性GBM标本中有5个是(E类)除了假栅栏坏死部位的最小染色外，基本上没有糖基化的CSPG。F类此外，没有发现明显的星形胶质细胞图案或包膜，而是GFAP+在整个肿瘤样本中检测到反应性星形胶质细胞，表明星形胶质细胞结构得到了保存。
图9。
图9。
CSPG介导的入侵抑制的假定模型。CSPGs介导对肿瘤细胞传播的内在和外在抑制。当受体和配体都表达时，肿瘤细胞（棕色）可以直接与糖基化的CSPG纤维（绿色）结合，本质上保持致密和离散的肿块。此外，大量的CS-GAG在瘤周反应性星形胶质细胞群（蓝色）中诱导显著的空间重排，可能是肿瘤细胞侵袭的二级外源性抑制剂。相对于与侵袭性病变相关的小胶质细胞，小胶质细胞（红色）也被诱导进入高度激活状态。在缺乏这些内在和外在的肿瘤侵袭阻断剂的情况下，GBM肿瘤细胞可以自由地在整个脑实质内广泛传播。
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