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.2013年11月1日；288(44):31761-71.
doi:10.1074/jbc。M113.514091。 Epub 2013年9月23日。

P-糖蛋白通过溶酶体隔离的新机制介导耐药性

山口铁雄 1, 苏米特·萨尼, Danae M夏普, 阿坎沙·阿尔文德, 帕特里克·詹森, 德斯·理查森
附属公司

P-糖蛋白通过一种涉及溶酶体螯合的新机制介导耐药性

山口铁雄等。 生物化学杂志. .

摘要

药物转运蛋白P-糖蛋白（Pgp）在质膜上的定位被认为是Pgp介导的多药耐药（MDR）的唯一原因。然而，很少有研究关注细胞内细胞器中表达的Pgp对耐药性的贡献。本研究描述了了解溶酶体Pgp如何参与MDR的另一种机制。这些研究是使用表达Pgp的MDR细胞及其非耐药对应物进行的。使用共焦显微镜和溶酶体分馏，我们证明细胞内Pgp定位于LAMP2染色的溶酶体。在Pgp表达细胞中，Pgp底物阿霉素（DOX）被隔离在LAMP2染色的溶酶体中，但在非Pgp表示细胞中未观察到这一现象。此外，溶酶体Pgp被证明是有功能的，因为在与已建立的Pgp抑制剂valspodar或elacridar孵育或用siRNA沉默Pgp表达后，DOX在该细胞器中的积累被阻止。重要的是，为了通过溶酶体诱导耐药性，细胞毒化学疗法（例如。DOX、柔红霉素或长春花碱）被要求作为Pgp底物，并在溶酶体pH（pH5）下电离，导致它们被隔离并滞留在溶酶体内。使用溶酶体嗜弱碱（NH4Cl、氯喹或甲胺）证明了这一特性，该碱增加溶酶体pH值，并且仅使Pgp表达细胞对此类细胞毒药物敏感。因此，对于非电离Pgp底物（例如秋水仙素或紫杉醇）或电离非Pgp基质（例如顺铂或卡铂），未发现溶酶体Pgp介导的MDR机制。总之，这些研究揭示了一种新的机制，即Pgp介导的化疗药物溶酶体隔离导致MDR，而MDR适合于治疗性开发。

关键词：化学生物学；耐化学性；氯喹；阿霉素；耐药性；药物运输；溶酶体；多药耐药；P-糖蛋白。

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数字

图1。
图1。
功能性Pgp导致DOX电阻。 A类Western blot分析表明，Pgp仅在KBV1（+Pgp）细胞中表达，而在KB31（−Pgp。β-肌动蛋白作为负荷对照。B类流式细胞术显示，KBV1（+Pgp）细胞中Pgp的质膜表达高于KB31（−Pgp）细胞。在流式细胞术分析之前，细胞未被渗透以防止细胞内Pgp染色。C、 与KB31（−Pgp）对照细胞相比，KBV1（+Pgp。简单地说，用对照培养基或Pgp抑制剂Val（1μ米)或Ela（0.1μ米)在37°C下保持30分钟。然后在存在或不存在这些抑制剂的情况下，在37°C下用Rh123（1μg/ml）加载细胞15分钟。D类，Pgp抑制剂增加[14C] 仅在KBV1（+Pgp）细胞中摄取DOX。简单地说，用对照培养基或Pgp抑制剂Val（1μ米)或Ela（0.1μ米)在37°C下保持30分钟。[14C] 然后添加DOX，在37°C下继续培养30分钟，然后清洗细胞。E类和F类，Pgp抑制剂阻止[14C] DOX仅来自KBV1（+Pgp）细胞。简单地说，细胞被标记为[14C] 在37°C下静置30分钟，清洗，然后在有或无Pgp抑制剂Val（1μ米)或Ela（0.1μ米).G公司、DOX细胞毒性（IC50/72 h）被Pgp抑制剂Val（1μ米)或Ela（0.1μ米)在KBV1（+Pgp）细胞中，但在KB31（−Pgp。中的结果A–C代表了三个实验，而D–G型为平均值±S.D.（三个实验，每个实验至少重复四次）。***，第页< 0.001与控件。
图2。
图2。
细胞内Pgp定位于KBV1（+Pgp）细胞中的溶酶体。 A类，Pgp与溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2，一种特征良好的溶酶体标记，箭头)，而DAPI（核标记物）未观察到共定位(B类)或MitoTracker®深红色(米托·德雷德，线粒体标记）(C类). 散点图、皮尔逊相关系数和曼德重叠系数A–C使用Imaris和Axiovision软件从所有细胞的细胞内隔间进行计算。照片是三个实验中的典型照片(A–C).比例尺=50微米。
图3。
图3。
溶酶体KBV1（+Pgp）细胞组分富含Pgp。 A类KBV1（+Pgp）细胞溶酶体富集组分显示(第页<0.001）与总细胞裂解物相比，酸性磷酸酶活性更高。B类，中富集溶酶体部分的蛋白质印迹分析A类表明溶酶体部分高度富集有Pgp。然而，该溶酶体部分不包含组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1型)线粒体SDHA水平与总细胞裂解物相似。蛋白质印迹分析A类和B类是平均值±S.D.（三个实验）。***，第页< 0.001与控件。
图4。
图4。
DOX与LAMP2染色溶酶体的克隆化是Pgp依赖性的。 A–D在对照条件下，在KB31（−Pgp）细胞中，DOX与核标记物DAPI共定位。E–L公司，Pgp抑制剂Val(E–H（E–H）)和Ela(I–L型)与对照组相比，未影响KB31（−Pgp）细胞中DOX的分布。M–P公司，将表达功能性Pgp的KBV1（+Pgp）细胞与DOX孵育，导致该药物与溶酶体标记LAMP2共定位(P（P）,箭头)而Pgp抑制剂Val(问-答)和Ela(U–X)导致DOX重新分布到细胞核。中的结果A–X是三个实验中的典型。比例尺=50微米。
图5。
图5。
KBV1（+Pgp）细胞中Pgp的功能性沉默导致DOX从LAMP2染色的溶酶体重新分布到DAPI染色的细胞核，并伴有毒性。 A类Western blot分析显示，与用Scr siRNA处理的KBV1（+Pgp）细胞相比，用两种Pgp siRNA（72小时，37°C）孵育的KBV1（+Pgp）细胞中的Pgp瞬时沉默。B类与siRNA孵育72小时后，KBV1（+Pgp）细胞中Pgp沉默导致细胞毒性增加（IC50/72 h），与经Scr siRNA处理的KBV1（+Pgp）细胞相比。Pgp抑制剂Ela（0.1μ米)与Pgp-siRNA-处理（Pgp-silenced）细胞相比，DOX仅在Scr-siRNA-治疗的KBV1（+Pgp）细胞中的细胞毒性增加（72小时，37℃）。C类DAPI染色显示，Pgp的siRNA沉默（72小时，37°C）导致DOX重新分布到细胞核，而Scr siRNA处理的KBV1（+Pgp）细胞导致DOX在LAMP2染色的溶酶体中积聚(箭头). 中的结果A类和C类是三个实验中的典型。中的图形B类是平均值±S.D.***，第页< 0.001与控制(即药物本身）。比例尺=50微米。
图6。
图6。
溶酶体中的Pgp赋予DOX耐药性。 A类，源于p的DOX物种形成图K（K）一显示100%DOX在溶酶体pH（pH～5）（9）下带电的值。B类和C类溶食性弱碱氯化铵（NH4氯，3米米)CLQ（1μ米)和MA（100μ米)增加灵敏度（IC50/72 h）在KBV1（+Pgp）细胞中DOX，但在KB31（−Pgp。D类，Western blot显示显著(第页<0.001）与2008（−Pgp）细胞相比，2008/P200（+Pgp。E类流式细胞术证实2008/P200（+Pgp）细胞中质膜Pgp的表达高于2008（−Pgp”）细胞。F、 与对照2008（−Pgp）细胞相比，对照2008/P200（+Pgp。用对照培养基或Pgp抑制剂Val（1μ米)或Ela（0.1μ米)在37°C下保持30分钟。然后在37°C下，在存在或不存在这些抑制剂的情况下，用Rh123（1μg/ml）加载细胞15分钟。G公司和H（H），用于B类和C类也使2008/P200（+Pgp）细胞对DOX敏感，但对2008（−Pgp50/72小时）。中的情节A类是使用Hyperquad2008生成的。中的结果B–H型来自三个实验。***，第页< 0.001与控制(即仅DOX）。
图7。
图7。
溶酶体Pgp增加Pgp底物DOX的溶酶体捕获，从而阻止DOX到达其核靶点。表达功能性Pgp的KBV1（+Pgp）细胞导致DOX的共定位(红色)带有溶酶体标记LAMP2(绿色)，导致图像合并后出现黄色荧光(箭头). 在KBV1（+Pgp）细胞中添加溶酶体嗜性弱碱，可以重新分配DOX(红色)来自溶酶体(绿色，LAMP2）到细胞核(蓝色，DAPI），导致合并图像中细胞核的紫色荧光。共聚焦显微镜的结果是三个实验的典型结果。比例尺=50微米。
图8。
图8。
Pgp赋予的耐药性依赖于酸性pH下Pgp底物的电荷。 A类，一系列Pgp底物的溶酶体捕获能力，如物种形成图所示（来源于pK（K）一每个基板的值（9、11、12、29））。溶酶体pH值（pH～5）时，DOX（100%）、DNR（100%）和VBL（71%）带电，而COL和PAC不带电。孵化（IC50/72小时）KB31（−Pgp）细胞(B类)或2008（−Pgp）细胞(C类)溶溶性弱碱氯化铵（NH4氯，3米米)CLQ（1μ米)，或MA（100μ米)未显著改变Pgp底物DOX、DNR、VBL、COL或PAC的细胞毒性。然而，Pgp表达的KBV1（+Pgp）细胞的培养(B类)或2008/P200（+Pgp）电池(C类)溶酶体嗜性弱碱显著增加了对Pgp底物DOX、DNR和VBL的敏感性，但不增加对COL或PAC的敏感性。图表(B类和C类)显示平均值±S.D.***，第页< 0.001与控制(即药物本身）。
图9。
图9。
溶酶体致弱碱对非Pgp底物药物的细胞毒性没有影响。将KB31（−Pgp）或KBV1（+Pgp(A类和B类)或卡铂(C类和D类)，两者都不是Pgp基板（32）。细胞在37°C下与顺铂或卡铂在存在或不存在溶食性弱碱氯化铵（NH）的情况下培养72小时4氯，3米米)CLQ（1μ米)，或MA（100μ米). 然后使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物分析评估增殖。结果显示为平均值±S.D.（三个实验）。
图10。
图10。
溶酶体被Pgp捕获作为一种替代的多药耐药性机制。 A类，作为内吞作用的一部分，含有Pgp的质膜向内芽，形成早期内吞体。在内吞过程中，Pgp的拓扑结构将反转，如其他膜蛋白（45）所示，导致底物运输到囊泡腔。随着内体成熟为溶酶体，它变得越来越酸化。溶酶体膜上的Pgp仍然具有功能，因为其催化活性位点和ATP-结合域仍然暴露在胞浆中（39，40）。当Pgp底物（如DOX）进入细胞时，药物不仅通过质膜上的Pgp流出细胞，而且通过溶酶体Pgp泵隔离到酸性溶酶体中。如果Pgp底物在酸性pH（如DOX）下带电，则发生溶酶体捕获。捕获带电药物将阻止Pgp底物到达其分子靶点(例如DOX的细胞核），导致Pgp表达细胞的阻力增加。B类，这项研究描述了克服溶酶体Pgp依赖性多药耐药性的两种机制：Pgp抑制剂直接阻断Pgp，从而阻止Pgp底物增加进入溶酶体(1)或细胞毒性药物的组合(例如DOX）具有溶溶性弱碱(例如CLQ）通过提高溶酶体pH值防止溶酶体捕获(2). 这两种方法为Pgp底物提供了一个机会，通过达到其靶点来克服多药耐药性，而不是被困在含有Pgp的溶酶体中。
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