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.2013年10月15日;191(8):4456-65.
doi:10.4049/jimmunol.1300827。 Epub 2013年9月18日。

体内天然免疫原性热休克蛋白的细胞哨兵鉴定

附属公司

体内天然免疫原性热休克蛋白的细胞哨兵鉴定

米歇尔·尼科尔·梅斯默等。 免疫学杂志. .

摘要

选择热休克蛋白(HSPs)家族的成员,如gp96,激发针对其伴侣肽的免疫反应。尽管迄今为止所描述的HSPs对APCs的免疫作用主要是通过培养的细胞系或原代细胞来证明的,但它们在体外的集体反应与启动免疫反应是一致的。在本研究中,我们检测了接种天然小鼠热休克蛋白后靶向小鼠的生理相关APC,并对这些细胞进行了表征。Gp96进入引流淋巴结的包膜下区域,在该区域主要由CD11b(+)细胞内化。获得gp96的细胞通过主动交叉递呈gp96肽并提供协同刺激,可以将保护性抗肿瘤免疫传递给幼年小鼠。我们的研究阐明了热休克蛋白如何提醒免疫系统细胞损伤,并将在癌症和传染病患者的免疫治疗中发挥至关重要的作用。

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数字

图1
图1。皮内免疫后gp96在淋巴结中的快速定位
(A) 用滴定剂量的gp96治疗C57BL/6小鼠A488型皮下注射。8小时后采集引流淋巴结并进行流式细胞术分析。显示的结果是3个独立实验的平均值,每组4-8只小鼠。(B) 接受10μg gp96的小鼠淋巴结A488型在指示的时间点收获,并如上所述进行分析。数据是三个实验的代表性数据,gp96组每个时间点5只小鼠,PBS每个时间点2只小鼠。(C)接受10μg gp96小鼠的淋巴结A488型在5小时时收获,打碎成单细胞悬浮液并进行显微镜分析。细胞核用赫斯特染料(蓝色)染色,A488显示为绿色。显示了两张放大40倍的图像,以显示带有低(黄色箭头)和高(白色箭头)gp96的单元格A488型染色。数据(A、B)表示为平均+/-SEM。
图2
图2。与gp96相关的淋巴结细胞表型分析A488型
通过多色流式细胞术分析来自未免疫或gp96免疫小鼠的淋巴结。(A) 接种10μg gp96后8小时A488型对总淋巴结和gp96+细胞进行CD11c和CD11b表达表型分析。CD11c群体为CD11b+/−和CD11b+人群为CD11c+/−.(B)A488型+CD11b型+淋巴结细胞还表现为CD4、CD8、Gr1.1、F4/80和MHC II。(C) A488型+CD11c公司+淋巴结细胞还表现为CD4、CD8、CD207、CD103和MHC II。接种10μg gp96后8(D)或48(E)小时A488型,采集淋巴结并对指定人群进行表型分析。gp96在每个人群中的分布以百分比表示,并与该人群在总淋巴结中的百分比进行比较。百分比是5只小鼠的平均值,代表了2个实验。数据以平均值+/-SEM表示。
图3
图3。gp96的分布A488型+淋巴结内的细胞
用10μg gp96免疫小鼠A488型8h后取引流淋巴结进行荧光显微镜分析。绿色表示gp96A488型荧光和蓝色是Hoechst核染色。(A) 放大10倍拍摄的图像。选择感兴趣区域(ROI,红框)进行进一步分析。(B) 分析CD11b(红色)和CD11c(白色)的ROI。(C) 20倍放大的图像显示CD8染色以显示T细胞区。(D) 使用IMARIS分析图像,并用gp96指示每个标记的共同定位A488型被量化并表示为百分比A488+超过共同本地化的阈值。每个标记(红色或白色)分别进行分析,并且可能与其他指示标记重叠。数据是分析的3个ROI的平均值。数据表示为平均+/-SEM。(E)切片在20倍放大率下对CD207进行染色。CD207与gp96的共定标A488型量化(D)。(F) 在40倍放大的切片上进行CD103染色(红色)。(G) (F)的ROI显示CD103(红色)与gp96的共同定位A488型(绿色)。共放大被量化(D)。图像和计算是两个独立实验的代表。
图4
图4。gp96对肿瘤免疫的过继转移A488型+淋巴结细胞
(A) 肿瘤免疫过继转移示意图。各组小鼠接种gp96488美元-ERK或gp96A488型6小时后取出引流淋巴结。第96页A488型+细胞通过FACS纯化并转移至幼年小鼠。将单独免疫ERK或PBS的小鼠的整个淋巴结细胞转移到其他幼年小鼠体内。1周后用CMS5肿瘤攻击受体小鼠。监测肿瘤生长。(B) 显示转移的门控细胞的典型FACS图。(C) 供体细胞转移后受体小鼠的CMS5生长曲线。从2个独立实验的2-8只受体小鼠中计算出的平均值*与gp96相比,p<0.05A488型收件人。(D) 移植经辐照的供体细胞后受体小鼠的CMS5生长曲线。平均值来自每组2-5只受体小鼠。
图5
图5。淋巴结APCs亚群CD91的表达。淋巴结
用多色流式细胞术分析细胞的CD11b、CD11c和CD91。(A) 首先对CD11b和CD11c亚群上的细胞进行门控,然后对每个群体的CD91的平均几何平均荧光强度进行量化,并与单独的次级荧光强度进行比较(B)。数据是三只小鼠+/-SEM的平均值,代表了三个实验。(C) 通过FACS分类、SDS-PAGE和免疫印迹证实CD11c/CD11b群体中CD91的表达。CD91β链(85kDa)由箭头标识。CD91阳性对照细胞系RAW264.7,阴性对照细胞系EL.4。
图6
图6。APC亚群对gp96的内吞能力差异
(A) 用滴定剂量的gp96孵育分离的淋巴结细胞A488型细胞通过流式细胞仪分析A488阳性,并表示为占总人口的百分比。(B) 淋巴结细胞被选入表达CD11c的人群+和/或CD11b+(C)用不同剂量的gp96培养淋巴结细胞后A488,对这些人群进行gp96内吞分析488美元。实验重复进行。(D) gp96的内吞作用A488型通过用20 nM gp96培养淋巴结细胞对指定人群进行测试A488型在指定的时间内。实验重复进行。(E) 通过混合纯化的CD11b群体来检测竞争性内吞作用CD11c公司+和CD11b+CD11c公司+gp96亚饱和细胞A488型。显示了电池混合物的典型FACS图。(F) A488阳性的(E)两个细胞群的分析以直方图形式呈现。(G) 通过混合纯化的CD11b群体来检测竞争性内吞作用+CD11c公司和CD11b+CD11c公司+存在gp96亚饱和量的细胞488美元细胞。显示了电池混合物的典型FACS图。(H) A488阳性的(G)中两组细胞的分析以直方图形式呈现。(一) gp96亚饱和量的内吞作用A488型由CD11b+CD11c公司+细胞,是否存在CD11b+单元格,如图所示。数据(A、C、D)表示为平均+/-SEM。
图7
图7。CD11b对HSP相关肽的交叉提呈+CD11c公司+BMDC
(A) CD11b的MHC I对HSP伴侣肽的交叉呈递+CD11c公司+通过用gp96-HELOVA培养细胞来测试细胞。B3Z的响应在595nm处测量为比吸光度。对照组包括仅含HELOVA的细胞、OVA、OVA 8肽和PBS。(B)CD11b的MHC II交叉呈现HSP相关肽+CD11c公司+通过用gp96-HELOVA培养细胞来测试细胞。用ELISA检测LC21对IL-2的反应。对照包括单独用HELOVA、HEL、HEL14肽和PBS培养细胞。(C–F)gp96A488型-b-pep20与CD11b孵育+CD11c公司+盖玻片上的细胞在37°C(C–E)或4°C(F)的温度下滑动指定的时间点,然后用链霉亲和素Cy3染色以获得肽(红色)和指骨肽(蓝色)。第96页A488型显示为绿色信号。(G-I)使用IMARIS和gp96的联合定位分析图像A488型用肽(G)、带指骨肽(H)的肽或带指骨素(I)的gp96定量。(J) 通用条款96A488型与CD11b孵育+CD11c公司+盖玻片上的细胞放置15分钟,然后固定细胞并染色LAMP-1(蓝色)和指骨苷(红色)。gp96的协同放大A488型IMARIS对LAMP-1进行了量化。(A)和(B)中的实验是3个独立实验的代表。(C–J)中的实验是来自众多独立实验的代表性图像。误差条是重复项(A和B)和(G–I)中的多个ROI的标准偏差。数据(A、B G–I)表示为平均+/-SEM。

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引用人

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