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.2013年11月15日;305(10):C1021-32。
doi:10.1152/ajpcell.00203.2013。 Epub 2013年9月18日。

单核细胞趋化蛋白诱导蛋白-1的抗dicer RNA酶活性对诱导血管生成至关重要

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单核细胞趋化蛋白诱导蛋白-1的抗dicer RNA酶活性对诱导血管生成至关重要

阿皮塔·罗伊等。 美国生理学杂志细胞生理学. .

摘要

炎症性血管生成涉及一个新基因ZC3H12A的诱导,该基因编码单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)诱导蛋白-1(MCPIP1),具有氘酶和解冻剂RNA酶活性。MCPIP1的这些酶活性是否以及如何介导MCPIP1的生物功能尚不清楚。目前对人脐静脉内皮细胞的研究表明,MCPIP诱导的血管生成是通过低氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和沉默信息调节因子(SIRT-1)诱导介导的,这些诱导导致血管生成抑制剂血小板反应蛋白-1的抑制。MCPIP1的表达抑制了抗血管生成小RNA(miR)-20b和-34a的产生,这两种小RNA分别抑制HIF-1α和SIRT-1的翻译。RNase-dead MCPIP突变体D141N不仅没有诱导血管生成,而且也没有抑制miR-20b和-34a的生成,这表明MCPIP1的解毒剂RNase活性参与了MCPIP介导的血管生成。miR-20b和-34a的嵌合抑制了MCPIP1诱导的血管生成,证实了MCPIP1抑制了miR-20b和-34a的生物发生。此外,我们的结果表明,MCPIP的表达可诱导HIF-1α的核移位。我们发现,在缺氧条件下,血管生成是通过MCPIP1的诱导介导的,在正常氧条件下,在体外,MCPIP氘化物泛素化的HIF-1α和稳定的HIF-α进入细胞核,促进其靶基因环氧合酶-2和VEGF的转录,提示MCPIP的氘激酶活性也可能促进血管生成。本研究首次表明,MCPIP1的解冻核糖核酸酶活性在介导MCPIP的生物功能,即血管生成中至关重要。

关键词:HIF-1α;MCPIP1;SIRT-1;miR-20b;miR-34a。

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图1。
图1。
低氧诱导的血管生成分化是通过单核细胞趋化蛋白-1(MCP1-1)诱导蛋白-1(MCPIP1)介导的。用小干扰(si)MCPIP或siScramble(Scra)转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)4h,然后用1%氧气(缺氧)诱导6h。对照组保持在21%氧气(常氧)下。6小时后,转录水平(A类)和蛋白质(B类)将低氧诱导因子(HIF-1α)标准化为内源性GAPDH后,评估其水平*P(P)< 0.05. 在常压下,HIF-1α蛋白水平无法检测到。转染4小时后(A类B类)在1%氧气(低氧)或21%氧气(常氧)诱导6小时之前,将细胞胰酶化并放置在Matrigel上。C类:给出了管状结构的相控显微照片。D类:表示管形成的相控显微照片的量化;在缺氧条件下计算siScra和siMCPIP之间的单因素方差分析*P(P)< 0.02. Bonferroni校正的事后分析表明,低氧条件下的试管形成在MCPIP敲除时被显著抑制。
图2。
图2。
MCPIP的强制表达导致HIF-1的核进入以及环氧合酶-2(COX-2)和VEGF的诱导。用MCPIP表达载体或空载体或siMCPIP转染HUVEC 24 h。A类:固定细胞,用抗HIF-1α抗体进行免疫细胞化学。用DAPI对细胞核进行复染。图像已合并。插入:原子核在×40。对总细胞裂解物进行MCPIP评估(B类)和HIF-1α蛋白(C类)层次*P(P)< 0.05.D类:HUVEC在转染MCPIP前3小时,用HIF-1α特异性siRNA或干扰siRNA作为对照。24小时后,通过实时PCR分离RNA进行转录分析,检测COX-2和VEGF的表达*P(P)< 0.05.
图3。
图3。
MCPIP通过p38 MAPK激活诱导血管生成。在用MCPIP表达载体转染HUVEC之前,用SB 203580(20μM)处理HUVECs。转染24小时后,对细胞进行胰蛋白酶处理,并用涂有p38抗体的珠免疫沉淀整个细胞裂解液(A类). 洗脱后,p38 MAPK与底物ATF2孵育。ATF2的磷酸化被用作测定放置在Matrigel上24小时的p38MAPK活性的方法(B类). 给出了管状结构的相控显微照片。管形成的相控显微照片的量化*P(P)< 0.002.
图4。
图4。
MCPIP诱导的血管生成是通过沉默信息调节器(SIRT-1)诱导介导的。用空载体(MAT)或MCPIP(MAT-MCPIP)转染HUVEC。24小时后,转录水平(A类)和蛋白质水平(B类)对SIRT-1进行评估*P(P)< 0.05.C类:将细胞胰蛋白酶化并放置在Matrigel上。D类:表示管形成的相控显微照片的量化;P(P)< 0.005.
图5。
图5。
MCPIP过度表达降低了抗血管生成因子、血小板反应蛋白-1(TSP-1)和血管生成抑制剂VEGI的水平。用MCPIP表达载体或空载体转染HUVEC 24小时。24小时后,转录水平(A类)进行TSP-1评估(*P(P)<0.02)和蛋白质水平(B类)以GAPDH为对照,用TSP-1抗体进行免疫印迹分析。在用MCPIP表达载体转染HUVEC之前,先用SIRT-1特异性siRNA或干扰(Scr)siRNA转染HU VEC 3 h。24 h后,转录水平(C类)进行TSP-1评估(*P(P)<0.02)和蛋白质水平(D类)以GAPDH为对照,用TSP-1抗体进行免疫印迹分析(*P(P)< 0.05).E类:用MCPIP表达载体转染HUVEC或以空载体作为对照。免疫印迹法检测p65核蛋白水平。组蛋白用于检查核提取物的纯度,并作为密度分析和转录水平的对照(F类)RT-PCR分析VEGI*P(P)< 0.05.
图6。
图6。
MCPIP-突变D141N导致血管生成潜能丧失。用MCPIP野生型(Wt)和MCPIP-突变-D141N表达载体转染HUVEC。24小时后,将细胞胰蛋白酶化并放置在基质上。描述了管形成的相控显微照片的量化*P(P)< 0.005.
图7。
图7。
MCPIP抑制抗血管生成microRNA(miR)-20b和miR-34a的生成,其模拟物抑制MCPIP诱导的血管生成。用空载体或MCPIP或RNase-dead突变体D141N转染HUVEC。24小时后,miR-20b的水平(A类)或miR-34a(B类)通过RT-PCR测定。C类D类:HUVEC经TNF-α(100 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml*P(P)< 0.01; #P(P)< 0.5.E类:在转染MCPIP表达载体之前,用miR-阴性对照(NC)miR-20b模拟物或miR-34a模拟物转染HUVEC 3 h。24小时后,将细胞胰蛋白酶化并放置在基质上。描述了管形成的相控显微照片的量化*P(P)< 0.005.
图8。
图8。
核糖核酸酶活性MCPIP突变体D141N的deubiquitase活性。A类:将MCPIP的泛素化HIF-1α底物与纯化的MCPIP(1μg)或泛素(Ub)醛在37℃孵育。1小时后,对混合物进行泛素抗体免疫印迹。B类:Ub-AFC(1μM)与MCPIP1或其突变体D141N(1μg)在37°C下孵育。使用不含任何蛋白的Ub-AFC作为阴性对照。在400 nm激发和505 nm发射时,以时间依赖的方式测量荧光。C类:将高分子量聚泛素(1μg)与纯化的MCPIP(1μg)或MCPIP突变体D141N(1μg37°C)孵育1h。用泛素抗体对反应混合物进行免疫印迹。
图9。
图9。
MCPIP诱导分化相关机制的示意图。MCPIP通过诱导HIF-1α和SIRT-1水平以及通过以下机制抑制NF-κB活化来介导血管生成分化(A类)并抑制miR-20b和miR-34a的水平(B类)从而增加HIF-1α和SIRT-1的水平。稳定的HIF-1α进入细胞核促进VEGF和COX-2的转录。SIRT-1水平升高可抑制血管生成抑制剂TSP-1的水平,从而促进MCPIP诱导的血管生成。SIRT-1也被报道可抑制NF-κB,进而导致TSP-1和miR-34a水平降低(C类)MCPIP负性调节NF-κB激活,导致血管生成抑制剂VEGI水平降低。较深的线表明,MCPIP的解冻活性在介导血管生成中至关重要。

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