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.2013;9（9）：e1003610。
doi:10.1371/journal.ppat.1003610。 Epub 2013年9月5日。

病毒RNA依赖性RNA聚合酶活性的RIG-I和MDA-5检测限制阳性RNA病毒复制

安德烈·尼科诺夫 1, 塔莫·莫尔德, 雷恩·西库特, Kaja Kiiver公司, 安德烈斯·梅尼克, Urve图茨, 阿列克塞·卢拉, 瓦莱丽亚·卢拉, 年龄Utt, 安德烈斯·梅里茨, 马特·乌斯塔夫
附属公司

病毒RNA依赖性RNA聚合酶活性的RIG-I和MDA-5检测限制阳性RNA病毒复制

安德烈·尼科诺夫等。 公共科学图书馆-病理学. 2013.

摘要

I型干扰素（IFN）对抗病毒反应很重要。黑色素瘤分化相关基因5（MDA-5）和维甲酸诱导基因I（RIG-I）蛋白检测细胞溶质双链RNA（dsRNA）或5'-三磷酸（5'-ppp）RNA并调节干扰素的产生。在病毒RNA复制和转录过程中，通过病毒RNA复制酶[RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）]产生细胞质5'-pppp RNA和dsRNA。在这里，我们证明了Semliki Forest病毒（SFV）RNA复制酶可以独立于病毒RNA复制和转录诱导IFN-β。SFV复制酶将宿主细胞RNA转化为5'-ppp-dsRNA，并通过RIG-I和MDA-5途径诱导IFN-β。SFV复制酶RdRp活性的失活可阻止IFN-β的诱导。这些IFN诱导的修饰宿主细胞RNA在野生型SFV及其非致病性突变体感染期间大量产生。此外，与野生型SFV复制酶相比，非致病性突变复制酶触发IFN-β生成增加，导致病毒复制停止。这些结果表明，宿主细胞可以通过检测非特异性病毒复制酶RdRp活性的产物来限制RNA病毒的复制。

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我读过该杂志的政策，但有以下冲突：TM RS KK AMäUT是FIT Biotech Oy的员工。MU是FIT Biotech Oy的高级副总裁。这不会改变我们对所有PLoS病原体共享数据和材料政策的遵守。

数字

图1
图1。具有完整RdRp活性的SFV复制酶的瞬时表达足以诱导IFN-β。
（A） SFV复制重建系统的方案。从相应的质粒DNA中表达引导SFV复制酶变异体（Rep、Rep-RDR和Rep-RDR/GAA）翻译的带帽RNA。封盖的SFVminRluc RNA是通过替换病毒编码序列（nsP1的N末端63 aa除外）从SFV4 RNA中提取的荧光素酶报告器编码序列。NTR，非翻译区域。将pSFVminRluc与pRep、pRep-RDR、pRep/RDR/GAA或不相关的“载体”DNA（模拟）联合转染（B和C）COP-5细胞。在指定的时间，制备细胞裂解物用于Renilla荧光素酶报告试验（B），并通过ELISA测定分泌到细胞培养上清液（C）中的IFN-β。（D） 用不同量的pRep、pRep-RDR或pRep-GAA转染COP-5细胞，以测量IFN-β的产生，如（C）所述。（E） 用不同数量的pRep-RDR、pRep-RDR/GAA或poly（I:C）dsRNA转染COP-5细胞，并按（C）所述测量IFN-β。使用编码EGFP的“填充”质粒使转染（D和E）中的DNA总量保持不变。（F） 用等量（1µg）的pRep-RDR、pRep-RDR/GAA、pNS5B或pNS5B-GND转染COP-5细胞，并按（C）所述测量IFN-β。误差条表示两个（B–D）和三个（E和F）实验的标准偏差。
图2
图2。突变的SFV复制酶以RIG-I-和MDA-5依赖的方式触发IFN-β。
（A） 用抗MDA-5、RIG-I和LGP2或其组合的siRNA转染COP-5细胞。48小时后，用poly（I:C）dsRNA转染细胞，24小时后，通过ELISA（上面板）测定分泌的IFN-β的量。通过免疫印迹分析（下面板）评估RLR蛋白敲除的效率。用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并用不同抗体进行免疫印迹。阴性。控制。，阴性对照非靶向siRNA；无siRNA的模拟转染。（B）如（A）所述，用siRNA转染COP-5细胞。48小时后，用pRep-RDR质粒DNA转染细胞，48小时后测量分泌的IFN-β的量，如（A）所述（上图）。RLR击倒效率（下面板）如（A）所述进行评估。使用nsP4和nsP2抗体分析SFV复制酶的表达；ACTIN被用作负荷控制。如（A）所述，用siRNAs转染（C和D）MEF。48小时后，用不同MOI的SFV4 Rluc-RDR感染细胞。在额外的12小时后，测量干扰素-β的量（C），并制备细胞裂解物用于肾素荧光素酶报告试验（D）。免疫印迹（A和B）和面板（C和D）是两个独立实验的代表性示例。误差线（A和B）表示三个实验的标准偏差***p<0.001（t检验）。
图3
图3。SFV复制酶产生的IFN诱导RNA的特性。
（A） 用pRep-RDR、pRep-RDR/GAA或poly（I:C）转染COP-5细胞或进行模拟转染。48小时后，对细胞进行裂解，并在硅胶柱上对总RNA进行分级。将含有大RNA（>200 nt）或小RNA（<200 nt）的两个结果组分转染到MEF中，24小时后用ELISA测定IFN-β水平。模拟转染，不含DNA或RNA；ND，不可检测；10×RNA<200，与大RNA相比，小RNA的摩尔过量为10倍。（B） 转染pRep-RDR的COP-5细胞在转染后48小时被裂解。提取总RNA并使用寡核苷酸（dT）亲和色谱将其分为多聚腺苷酸和非多聚腺苷酸RNA组分。越来越多的获得的RNA组分被转染到COP-5细胞中，而总RNA量与“填充”RNA（原始COP-5总RNA）保持恒定。转染后24小时，通过ELISA测定细胞培养基中IFN-β的量。聚A+，聚腺苷酸；聚A−，非聚腺苷酸化。（C） 上面板：dsRNA探针用不同数量的指示RNase处理，在琼脂糖凝胶上分离，然后通过溴化乙锭染色进行可视化。下面板：从pRep-RDR-转染细胞中提取总RNA，并用不同数量的指示RNase消化，或用DNase I或碱性磷酸酶（AP）处理，并按（C，上面板）所述进行分析。模拟，没有添加酶。（D） RNAs（C，下表）转染COP-5细胞，24小时后用ELISA测定分泌IFN-β的量。误差条（A、B和D）代表两个实验的标准偏差。
图4
图4。溶酶体和内体富含由突变病毒复制酶产生的干扰素诱导RNA。
（A） 用pRep-RDR或pRep-RDR/GAA质粒DNA转染COP-5细胞。48小时后，制备核后上清液（PNS），并以蔗糖梯度进行浮选分离。随后，用从每一组分中提取的RNA以等摩尔量转染原始COP-5细胞，并用ELISA测定IFN-β水平。Lys+LE、溶酶体和晚期内体；EE，早期内体；高尔基+ER、高尔基复合体和内质网；细胞色素，胞浆。（B） 用pRep、pRep-RDR或pRep-RDR/GAA质粒DNA转染COP-5细胞。48小时后，将细胞固定、渗透并用抗nsP1和抗dsRNA抗体染色。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚二氢氯化物对细胞核进行复染。（C） 用pRep-RDR质粒DNA转染RD细胞。48小时后，将细胞固定、透化并用抗nsP1、抗dsRNA和抗LAMP2抗体的不同组合染色。如（B）所述，对细胞核进行复染。误差线（A）表示两个实验的标准偏差。所有图像（B和C）都是三个独立实验的代表。
图5
图5。病毒复制酶增加的I型干扰素诱导触发突变型SFV复制的停止。
（A–D）MEF在37°C下感染SFV4-Ruc和SFV4-Luc-RDR，MOI为1。在指定的时间，制备细胞裂解物用于肾素荧光素酶报告试验（A）、western blot试验（C和D），并通过ELISA测定分泌到细胞培养上清液（B）中的IFN-β。RLU，相对光单位；ND，不可检测；h.p.i.，感染后小时数；*，非特异性细胞蛋白，由nsP4抗体识别。（E–H）MEF在37°C（E和F）或28°C（G和H）下以不同的MOI值感染突变的SFV4-Ruc-RDR报告病毒，然后进行功能分析，如（A–D）所述。（一） 病毒复制酶驱动的封闭SFV4-Ruc-RDR病毒RNA基因组复制和转录方案。风险回收率→RDR、nsP2 NLS突变；SG，亚基因启动子；n、 残基数量可变；（+），阳性标记RNA；（-），负链RNA。（J）MEF在37℃或28℃感染SFV4-Ruc-RDR病毒，MOI为0.1或MOI为1。提取总RNA并用地高辛UTP标记的RNA-probe对病毒阳性（上面板）或阴性（下面板）RNA链进行northern印迹分析。每条通道中装载了等量的总RNA。这些数据代表了两个（A、B和J）或三个（E–H）独立实验。免疫印迹（C和D）是两个独立实验的代表性示例。
图6
图6。野生型和突变型SFV在IFN诱导方面不同，但产生的PAMP数量相似。
（A和B）MEF在37°C下感染SFV4-Ruc和SFV4-Luc-RDR，MOI为1。在12 h.p.i.时，制备细胞裂解物用于肾素荧光素酶报告试验（A），并通过ELISA测定分泌到细胞培养上清液（B）中的干扰素-β。（C和D）将从感染或模拟感染的MEF细胞中提取的越来越多的Trizol反应剂和紫外线照射的总RNA转染到COP-5细胞中，同时使用“填充物”RNA（来自幼稚COP-5的总RNA）使RNA量保持不变（1000 ng）。转染后12小时，测定肾素荧光素酶报告活性（C），并用ELISA（D）测定细胞培养液中分泌的IFN-β的量。RLU，相对光单位；ND，不可检测；h.p.t.，转染后小时。误差条（A–D）表示两个独立实验的标准偏差。
图7
图7。SFV感染期间IFN-β的诱导不能仅用病毒特异性RNA的存在来解释。
（A） 通过寡聚（dT）亲和色谱分离从模拟、SFV4 Rluc-和SFV4 Rluc-RDR感染的MEF细胞中提取的总RNA获得的聚腺苷酸化（polyA+）和非聚腺苷酸化（polyA-）RNA级分。在非变性0.8%琼脂糖凝胶上使用电泳分离RNA样品（500 ng/条），并通过溴化乙锭染色进行可视化。用ImageJ定量42S（±）dsRNA的数量；结果显示在3、4、5、6车道的底部。pA+，聚腺苷化RNA部分；pA-，非多聚腺苷酸化RNA部分；RNA M1，RNA标记1（顶部–6，4，3，2，1.5，1.0，0.5，0.2–底部，Knts）；RNA M2，RNA标记2（顶部–1，0.8，0.6，0.4，0.3，0.2，0.1–底部，Knts）；DNA M，DNA标记（顶部–10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.0、0.75、0.5、0.25–底部，Kbps）。（B） （A）中显示的PolyA+和PolyA−RNA组分在变性甲醛0.8%琼脂糖凝胶上通过电泳分离，并转移到尼龙膜上。随后，使用片段化DIG标记的SFV4-Ruc RNA探针（200 ng/ml）进行北方杂交分析。将等量的RNA（30 ng）加载到每条通道中。（C） （A）中所示的增加数量的RNA经紫外线处理并转染到COP-5细胞中，而总RNA数量与“填充”RNA（来自原始COP-5电池的总RNA）保持不变。转染后12小时，通过ELISA测定细胞培养液中IFN-β的含量。ND，不可检测；h.p.t.，转染后小时。（D） 在硅胶柱上对（A）中所示的非聚腺苷酸化RNA部分进行分级，并在0.8%的非变性琼脂糖凝胶上分析1/10体积的RNA；用溴化乙锭染色观察RNA。（E） 将（D）中显示的大RNA（>200 nt）或小RNA（<200 nt）转染COP-5细胞，12小时后用ELISA检测IFN-β水平，未检测到；h.p.t.，转染后小时；10×RNA<200，与大RNA相比，小RNA的摩尔过量为10倍。误差线（C和E）表示三个独立实验的标准偏差。
图8
图8。SFV复制酶转录宿主细胞RNA，在SFV感染期间触发IFN-β诱导。
（A） 通过寡核苷酸（dT）亲和层析从模拟、SFV4-Ruc-和SFV4-Luc-RDR感染的MEF细胞提取的总RNA中分离得到等量（1µg）的polyA−RNA组分，用RNA 5′多磷酸酶处理（右）或不处理（左）。随后，RNA要么变性（黑条），要么不变性（白条），并转染到COP-5细胞中。转染后12小时，通过ELISA测定细胞培养液中IFN-β的含量。ND，不可检测；h.p.t.，转染后小时。（B） 通过在天然低熔点0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，解析SFV4-Ruc polyA−RNA部分，并纯化病毒dsRNA RF 42S（±）、病毒ssRNA 26S（+）/28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA对应的RNA物种。随后，将获得的RNA物种进行模拟、RNase T1和碱性磷酸酶（AP）处理，并转染到COP-5细胞中，同时总RNA量与“填充”RNA（来自原始MEF细胞的总RNA）保持恒定。转染后12小时，通过ELISA测定细胞培养液中IFN-β的含量。h.p.t.，转染后小时。（C） 用于标记和扩增由SFV复制酶产生的RNA片段的策略示意图（顶部）。使用2%琼脂糖凝胶电泳（在三硼酸盐edta缓冲液中）（底部）解析获得的PCR产物。DNA M，DNA标记（顶部–700、500、400、300、200、150、100、75、50、25–底部，bps）。（D） 使用策略识别的唯一克隆RNA，如（C）所示。干环RNA的示意图基于小鼠ASncmtRNA-1和人ASncmtRNA-2的序列比对（BLASTN 2.2.28+[91]），因为后者的这种结构已通过实验得到证实。（A） 和（B）是两个独立实验的代表。
图9
图9。成纤维细胞中突变型SFV复制限制模型。
SFV复制酶对宿主细胞RNA的转录导致产生5′-ppp dsRNA，由RLR（RIG-I和MDA-5）检测到。随后，诱导并分泌I型干扰素。释放的I型干扰素激活干扰素刺激基因（ISG）的转录，通过降解SFV基因组触发病毒复制限制。
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