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.2013年11月21日；122(22):3642-50.
doi:10.1182/bloud-2013-06-506691。 Epub 2013年9月12日。

血小板源性ERp57通过调节αIIbβ3整合素介导血小板并入生长血栓

王璐 1, 易武, 周俊松, 赛义德·艾哈迈德, 布伦特·穆特斯, 纳塔利奥·加比, 格林特·哈默林, 刘俊玲, 大卫·W·埃塞克斯
附属公司

血小板源性ERp57通过调节αIIbβ3整合素介导血小板并入生长血栓

王璐等。 血液. .

摘要

血小板蛋白二硫键异构酶ERp57介导血小板聚集，但其在血栓形成中的作用尚不清楚。为了确定血小板衍生ERp57在止血和血栓形成中的特定作用，我们生成了巨核细胞/血小板特异性敲除。尽管血小板计数和血小板糖蛋白表达正常，但ERp57缺乏小鼠的尾出血时间和血栓闭塞时间因三氯化铁引起的颈动脉损伤而延长。使用肠系膜动脉血栓模型，我们发现ERp57缺陷血小板在生长血栓中的掺入减少。缺乏ERp57的血小板对αIIbβ3整合素的激活和血小板聚集有缺陷。通过添加外源性ERp57纠正聚集缺陷，使表面ERp57参与血小板聚集。利用ERp57突变体，我们证明第二个活性位点靶向血小板表面底物，以增强血小板聚集。Alexa 488标记的ERp57与凝血酶活化和Mn（2+）处理的缺乏β3的血小板的结合显著降低，表明ERp57与αIIbβ3直接相互作用。ERp57蛋白的表面表达和人类血小板的活性随着血小板的活化而增加，蛋白表达发生在生理相关的时间范围内。总之，血小板衍生ERp57在激活该受体的过程中与αIIbβ3直接相互作用，是血小板并入生长血栓所必需的。

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数字

图1
图1
Pf4-Cre/ERp57血小板的特性飞行/飞行 老鼠。（A） 单克隆抗ERp57抗体（Mab1）通过western blot与小鼠ERp57反应（PLCγ2负载控制；30μg蛋白质）。（B） 血小板逆转录聚合酶链反应产物ERp57飞行/飞行和Pf4-Cre/ERp57飞行/飞行老鼠。ERp57的引物在野生型血小板中产生了预测的186-bp产物，但在ERp57缺失的血小板中没有。Cre重组酶的引物在Cre阳性ERp57缺陷血小板中预测出450-bp的产物，但在野生型血小板中没有。小鼠β-肌动蛋白的引物产生预测的265-bp产物。（C） 使用抗ERp57抗体对裂解产物进行Western blot（PLCγ2对照）。显示了PDI、ERp72和ERp5的印迹结果。在B-C组中，特定RNA或蛋白质的通道在同一凝胶上运行，但不连续。（D） ERp57中的血小板计数飞行/飞行和Pf4-Cre/ERp57飞行/飞行小鼠±SE（n=10）。（E） Pf4-Cre/ERp57血小板糖蛋白的正常表达飞行/飞行小鼠与ERp57的比较飞行/飞行窝友控制±SE（n=8）。小鼠血小板与αIIbβ3、GPIb或GPVI抗体孵育，并通过流式细胞术进行分析。
图2
图2
血小板源性ERp57是止血、血栓形成和血小板聚集形成血栓所必需的（A）尾部出血时间和（B）FeCl闭塞时间三-Pf4-Cre/ERp57诱导的颈动脉血栓形成飞行/飞行小鼠与ERp57的比较飞行/飞行室友控制。（C） 纳入ERp57血小板飞行/飞行或Pf4-Cre/ERp57飞行/飞行小鼠进入正在生长的血栓。（D） FI/µm复合材料2在ERp57中飞行/飞行，•（n=18）和Pf4-Cre/ERp57飞行/飞行, ■ （n=16）小鼠±SE*P（P）< .05. 平均血管直径；ERp57型飞行/飞行114.8 ± 5.7; 第4-Cre/ERp57页飞行/飞行: 111.1 ± 5.4 (P（P）=NS）。虚线标记容器壁。白条=100µm。图像放大倍数为×100。
图3
图3
血小板ERp57缺乏会损害αIIbβ3的激活和血小板聚集。（A） ERp57缺乏的血小板在αIIbβ3的活化方面存在缺陷（由JON/A活化依赖性抗体检测）。描述了一个代表性样品和累积数据±SE（n=5）的平均荧光强度（MFI）。（B） 代表性聚集追踪和综合结果（n=6）显示了使用卷心菜素（300 ng/mL）的ERp57缺陷血小板的聚集缺陷。（C） 修正Pf4-Cre/ERp57的聚集缺陷飞行/飞行通过添加ERp57相对ERp57的血小板飞行/飞行控制血小板。其他实验表明，通过添加50或100 nM ERp57（每种情况下n=3）可以纠正ERp57缺陷血小板的聚集缺陷。添加重组ERp57 5分钟，然后通过卷心菜毒素（150 ng/mL）诱导聚集。
图4
图4
ERp57的第二个活性位点对血小板聚集至关重要。（A-D）用ERp57突变体（ss-oo或oo-ss）预孵育人类血小板的效果。对照组为野生型（ss-ss）或完全失活ERp57（oo-oo）。用卷柏素（A）或凝血酶（C）刺激亚最大聚集（基线）。单个实验的代表性跟踪显示，在添加激动剂前10分钟添加ERp57（2µM）的效果。面板B、D是相应的累积数据±SE（n=3）。oo-oo和ss-oo之间，或oo-ss和ss-ss之间的卷心素或凝血酶没有统计上的显著差异。
图5
图5
ERp57与小鼠血小板上的β3整合素相互作用。（A） Alexa 488-ERp57与非活化（NA）和凝血酶活化（Act）野生型（WT）小鼠血小板的结合。（B） ERp57与未激活的WT和β3-null血小板的结合呈现重叠曲线。（C） ERp57与凝血酶激活的WT和β3-缺失血小板的结合。（D） ERp57与凝血酶活化血小板结合的累积数据±SE（n=3）。（E） 与Mn结合2+-处理过的血小板。（F） ERp57与锰结合的累积数据2+-治疗血小板±SE（n=3）。洗净的小鼠血小板（3×108/mL）与Alexa 488-ERp57（30µg/mL）在37°C下预培养10分钟，然后被凝血酶（0.3 U/mL）激活5分钟或用Mn处理2+（5 mM）在37°C下保持10分钟。流式细胞术检测Alexa 488-ERp57的表面结合。
图6
图6
血小板表面ERp57蛋白随着血小板活化而增加。用多克隆抗ERp57抗体（Ab1）检测表面表达，以响应卷心菜毒素（A）和SFLLRN（B）。用抗ERp57单克隆抗体Mab1（C）或Mab2（D）检测表面表达。左侧面板显示了非活化血小板（NA）和活化血小板（Act）的典型结果；右侧面板显示了几个实验±SE的MFI（A，n=8；B，n=4；C，n=5；D，n=五）。在分析之前，血小板与卷柏毒素或SFLLRN孵育5分钟。当使用初级单克隆抗体时，使用次级PE-标记的抗鼠抗体。（E） 凝血酶（3 U/mL）±SE（n=3）作用下血小板表面ERp57表达的时间进程。左面板，代表性流量直方图；右侧面板MFI±SE（n=3）。（F） Mab1与ERp57结合飞行/飞行血小板，而不是ERp57缺陷血小板。显示了Mab1与未活化的血小板和表达（ERp57飞行/飞行)或缺乏ERp57（Pf4-Cre/ERp57飞行/飞行). 用卷柏毒素（600 ng/mL）激活血小板。未激活和激活ERp57缺陷血小板的曲线是重叠的。（G） 累积数据显示Mab1与用卷柏毒素（1µG/mL）或凝血酶（3 U/mL）±SE（n=3）激活的小鼠血小板结合。
图7
图7
血小板表面ERp57活性随着血小板活化而增加。（A） Di-E-GSSG转化为EGSH随着血小板活化而增加。抑制性Mab1和非抑制性Mab2对非活化血小板（B）和活化血小板（C）的影响。这些曲线来自3个不同实验的组合数据。凝胶过滤血小板（4×108/用α-凝血酶（0.5 U/mL）活化10分钟。然后在所示浓度下添加抗体10分钟。加入Di-E-GSSG和DTT，使最终血小板浓度为4×107/mL、Di-E-GSSG和DTT浓度分别为150 nM和5µM。如前所述，使用Spectra-Max M2荧光仪（分子器件）监测Di-E-GSSG转化为EGSH的过程。
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