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.2013年10月18日；288（42）：30387-30398。
doi:10.1074/jbc。M113.490581。 Epub 2013年9月6日。

葡萄糖缺乏的细胞不参与生存前的自噬

西尔维娅·拉米雷斯-佩纳多 1, 克拉拉·卢西亚·莱昂·安尼基亚里科 1, 哈维尔·加林多·莫雷诺 1, 拉斐拉·伊尔拉罗 1, 阿尔弗雷多·卡罗·马尔多纳多 1, Jochen H M Prehn先生 2, 凯文·M·瑞恩 3, 克里斯蒂娜·穆尼奥斯·皮内多 4
附属公司

缺乏葡萄糖的细胞不参与生前自噬

西尔维娅·拉米雷斯-佩纳多等。 生物化学杂志. .

摘要

为了应对营养素缺乏或细胞器损伤，细胞会进行大量自噬。葡萄糖是一种必需的营养素，饥饿会促进哺乳动物细胞的自噬。因此，我们旨在确定自噬在葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡中的作用。葡萄糖戒断诱导细胞死亡，可通过凋亡（在Bax、Bak缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞或HeLa细胞中）或坏死（在Rh4横纹肌肉瘤细胞中）发生。通过使用3-甲基腺嘌呤、氯喹（ATG4B的主要阴性形式）或沉默Beclin-1、Atg7或p62，通过化学或遗传手段抑制自噬，表明大自噬不能保护葡萄糖剥夺后发生坏死或凋亡的细胞。此外，尽管mTOR被抑制，但在所分析的四种细胞系中，葡萄糖剥夺并没有诱导自噬通量。事实上，葡萄糖缺乏抑制了基础自噬流量。相反，糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖诱导了前生存自噬。进一步分析表明，在没有葡萄糖的情况下，由其他刺激诱导的自噬通量受到抑制。这些数据表明，应该重新考虑自噬在营养素饥饿反应中的作用。

关键词：细胞凋亡；自噬；葡萄糖；坏死（坏死性死亡）；m任务大纲。

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数字

图1。
图1。
3-甲基腺嘌呤抑制葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡或坏死。 A类和B，在指定浓度下，在没有或存在3-MA的情况下，HeLa细胞被剥夺葡萄糖。16岁时通过碘化丙啶掺入分析细胞死亡(A类)或24小时(B). 该图显示了三个实验的平均值和S.E。C类，Bax/Bak−/−在没有或存在3-MA的情况下，在指定的浓度下，对MEF进行指定时间的葡萄糖剥夺。收集细胞用于亚G1所示时间的分析。该图显示了三个实验的平均值和S.E。D类，Bax/Bak−/−MEF用10 m处理米在有或无葡萄糖的情况下，3-MA持续48小时。照片显示80%的区域，使用20倍物镜拍摄。请注意，3-MA可防止葡萄糖缺乏引起的细胞收缩。E类Rh4细胞在无葡萄糖培养基中生长，并以caspase抑制剂（Q-VD）或DMSO作为载体对照。在指定的时间收集细胞并进行碘化丙啶处理(圆周率)摄取分析。数据表示三个实验的平均值和S.E。未处理的对照细胞（标记C类)细胞在DMEM中培养16小时。F类和G公司，Rh4细胞在没有或存在指定浓度的3-MA的情况下被剥夺葡萄糖。通过碘化丙啶掺入分析24小时时的细胞死亡(F类)或37小时(G公司). 该图显示了至少三个实验的平均值和S.E。H（H），用10 m米3-MA，在有或无葡萄糖的情况下保持30小时。使用20倍物镜拍摄25%的现场照片。不适用。，不显著；二甲基亚砜，二甲基亚砜。
图2。
图2。
氯喹抑制溶酶体功能可促进对葡萄糖剥夺的轻度敏感性。3-MA和氯喹对2-脱氧葡萄糖敏感。A类，Rh4细胞在没有或存在氯喹的情况下被剥夺葡萄糖(CQ公司)在指定浓度下。24小时后通过碘化丙啶掺入分析细胞死亡。图中显示了至少四个实验的平均值和S.E。B，Bax/Bak−/−MEF在没有或存在10μ米氯喹。48小时后通过碘化丙啶掺入分析细胞死亡。图中显示了三个实验的平均值和S.E。C类和D类在没有或存在指定浓度的氯喹的情况下，HeLa细胞被剥夺葡萄糖。通过在指定时间掺入碘化丙啶分析细胞死亡。显示了至少三个实验的平均值和S.E。E类，用2 m米在不存在或存在指示浓度的氯喹的情况下的2-DG。48和72小时后，通过碘化丙啶掺入分析细胞死亡。显示了六个实验的平均值和S.E。F类，用2 m米2-DG，在指定浓度下，不存在或存在3-MA。用碘化丙啶分析细胞死亡(圆周率)48和72小时后合并。该图显示了至少四个实验的平均值和S.E。G公司，Rh4细胞与蛋白酶抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A（20μ米每个）在常规介质（−）或EBSS中，在有或无3-MA（10m米)，并对LC3和肌动蛋白进行印迹。不适用。，不显著。
图3。
图3。
抑制自噬对2-脱氧葡萄糖和饥饿缓冲液敏感，但对葡萄糖剥夺不敏感。 A类和B用抗Beclin-1或对照siRNA转染Rh4细胞。A类转染后48 h，分别用2-DG和bafilomycin处理细胞48 h(Baf公司)孵育最后3小时。收集蛋白质进行Western blot。B转染细胞48小时后，用2-DG、EBSS处理细胞，或进行指定时间的葡萄糖剥夺。给出了五个实验的平均值和S.E。C类，用mStrawberry（对照）或mStrawberry-Atg4B（C74A）质粒转染Rh4细胞，并孵育24 h。然后将细胞在EBSS、Glc+、Glc-或2-DG中培养指定时间，荧光（转染）细胞在低浓度DAPI下被评为死细胞或活细胞（见“实验程序”）。D–F，Bax/Bak−/−用抗ATG7或对照siRNA的siRNA转染MEF(NT公司，5′-UAAGGCUAUGAGAUACtt）。D类在指定时间采集样本进行Western blot。E类转染48h后，细胞在常规培养基或EBSS 95%+5%培养基和巴非霉素培养基中培养3h，收集进行Western blot。F类转染细胞48小时后，在Glc+、Glc-或thapsigargin（1μ米)并收集用于FACS分析。给出了三个实验的平均值和S.D。G公司，Bax/Bak−/−用抗p62或对照siRNA的siRNA转染MEF。48小时后，它们被剥夺葡萄糖。通过亚G分析细胞死亡1分析。给出了两个实验的平均值和S.D。右侧面板，在转染后的指定时间收集细胞进行Western blot分析。圆周率，碘化丙啶；纳秒，不显著。
图4。
图4。
葡萄糖缺乏不会引起自噬流量。 A–D、希拉(A类和B)或Rh4(C类和D类)稳定转染GFP-LC3（HeLa-LC3，Rh4-LC3）的人用DMEM处理葡萄糖（Glc+）、葡萄糖剥夺（Glc-）、氨基酸剥夺（Hank’s平衡盐溶液/EBSS）或雷帕霉素(拉帕)加入或不加入巴非霉素6小时(Baf公司)最后3小时，在共焦显微镜下检测GFP-LC3的表达模式。按照“实验程序”中的描述测量细胞中的点状LC3B和D类显示2的平均值+S.E.（HeLa，B)或四个（Rh4，D类)独立实验。E类用mRFP-GFP-LC3质粒转染Rh4，转染后24小时处理15小时。显示了三个独立实验的典型图像。箭头表明红色点（自噬体）。
图5。
图5。
通过2-脱氧葡萄糖和饥饿而非葡萄糖剥夺诱导自噬流量。 A类在E64d和胃蛋白酶抑制素A存在或不存在的情况下，去除HeLa细胞的葡萄糖或在95%EBSS+5%培养基中培养指定时间(欧洲药典) (10 μ米每个）。蛋白质通过SDS-PAGE和免疫印迹进行解析。显示了抗LC3抗体和抗p62抗体的免疫反应带。未处理的对照细胞（标记c（c）)细胞在DMEM中培养3小时下部面板显示了“实验程序”中所述的相对LC3 II水平的量化（至少三个独立实验的平均值和S.E.）。B，Bax/Bak−/−MEF受到葡萄糖剥夺或在95%EBSS+5%培养基中孵育指定时间，在没有或存在20 n的情况下米巴菲尔霉素(Baf公司)最后3小时避免中毒。未处理的对照细胞（标记为c（c）)细胞在DMEM中培养6小时(B)或缺席(C类)巴非霉素持续3小时。显示了与抗LC3抗体和抗p62免疫反应的条带。这个下部面板显示了“实验程序”中所述的相对LC3 II水平的量化（三个独立实验的平均值和S.E.）。C类，在不存在或存在20n的条件下，对Rh4细胞进行葡萄糖剥夺或在90%EBSS+10%培养物DMEM中孵育指定的时间米巴非霉素持续3小时以避免毒性。未经处理的对照细胞是在DMEM中培养3小时的细胞(B)或缺席(C类)最后3小时，通过SDS-PAGE和免疫印迹解析蛋白质。这个下部面板显示了“实验程序”中所述的相对LC3 II水平的量化。结果代表了三个独立实验；两个用于EBSS。D类，Rh4细胞在没有或存在20 n的情况下，用2-DG处理指定时间米将未经处理的对照细胞在DMEM中培养3小时(B)或缺席(C类)巴非霉素持续3小时下部面板显示了“实验程序”（三个独立实验）中所述的相对LC3 II水平的量化。
图6。
图6。
葡萄糖缺乏会激活饥饿信号，但会抑制自噬。 A类用无葡萄糖培养基、2-DG或二甲双胍处理Rh4细胞(遇见)在指定的时间内。蛋白质通过SDS-PAGE和免疫印迹进行解析。使用二级红外抗体检测磷酸-4E-BP1、4E-BP1，磷酸S6、S6和肌动蛋白。B，HEK293细胞在无葡萄糖培养基中培养，有无葡萄糖。蛋白质通过SDS-PAGE和免疫印迹进行解析。磷酸化和总乙酰辅酶A羧化酶(行政协调会)使用红外抗体检测S6蛋白、4E-BP1和肌动蛋白。C类，HEK293细胞被剥夺葡萄糖的时间显示有或没有E64d和胃蛋白酶抑制素A(欧洲药典)浓度为20μ米收集每个样本，并进行免疫印迹。D类，Bax/Bak−/−在MEF中加入或不加入葡萄糖（Glc−）或EBSS治疗指定时间（以小时为单位），然后在指定时间内加入3-MA治疗2小时，并收集用于Western blot。E类，Rh4细胞在无葡萄糖或富含葡萄糖的培养基中孵育15 h，在有或无E64d和胃蛋白酶抑制素A的情况下孵育20μ米在有或无mTOR抑制剂NVP-BEZ-235（缩写为BEZ）的情况下，按所示浓度进行。蛋白质通过SDS-PAGE和免疫印迹进行解析。显示了LC3、磷酸化4E-BP1、4E-BPl、磷酸化S6、S6和p62的免疫反应带。F类，如中所述处理的细胞的LC3 II水平的定量E类将数值归一化为肌动蛋白和在E64d和胃蛋白酶抑制素存在下处理的细胞对照(Glc公司+欧洲药典). 结果显示了三个独立实验的平均值和S.E。安星号表明与葡萄糖存在下的相同治疗相比，显著性>0.05。
图7。
图7。
ATP水平或溶酶体pH值不能解释葡萄糖缺乏的影响。 A类Rh4细胞在无葡萄糖培养基中或在2-DG存在下培养指定时间。按照“实验程序”中的描述测量ATP水平。所示值与每个时间点的未处理对照组相关，代表三个（2-DG）或六个（Glc-）独立实验的平均值和S.E。B，Bax/Bak−/−MEF和HeLa细胞在有无Q-VD的情况下用无葡萄糖培养基处理指定时间。误差线表示三个值的平均值（Bax/Bak−/−MEF）或五个（HeLa）独立实验。ATP水平标准化为每个孔中的细胞数。C类，用100 n米无葡萄糖培养基和BEZ（NVP-BEZ-235）。ATP水平按照“实验程序”所述进行测量。所示值与每个时间点的未经处理的对照组相关。数据表示三个独立实验的平均值和S.E。D类和E类，Bax/Bak−/−MEF公司(D类)或Rh4细胞(E类)在Glc+、Glc+巴非霉素中培养(Baf公司；20牛顿米)、EBSS、Glc-或2-DG（10米米)在指定的时间内。胰酶化后，细胞用2.5μ米Lysosensor（LifeTechnologies）在37°C下保持10分钟。用FACS分析活细胞的平均溶菌素传感器强度。所示数据与未经处理的对照组相关，代表三个独立实验的平均值和S.E。
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