The membrane-proximal KXGFFKR motif of α-integrin mediates chemoresistance

doi:10.1128/MCB.00580-13

.2013年11月；33(21):4334-45.

doi:10.1128/MCB.00580-13。 Epub 2013年9月3日。

α-整合素膜近端KXGFFKR基序介导化疗耐药

刘池超¹, 帕斯卡·莱克莱尔, 什永Quin Yap, 钦滕·詹姆斯·林

附属公司

PMID： 24001772
预防性维修识别码：项目经理3811891
内政部： 10.1128/MCB.00580-13

α-整合素膜近端KXGFFKR基序介导化疗耐药

刘池超等。分子细胞生物学. 2013年11月.

.2013年11月；33(21):4334-45.

doi:10.1128/MCB.00580-13。 Epub 2013年9月3日。

作者

刘池超¹, 帕斯卡·莱克莱尔, 什永Quin Yap, 钦滕·詹姆斯·林

附属

¹儿科。

PMID： 24001772
预防性维修识别码：下午3081891
内政部： 10.1128/立方米.00580-13

摘要

细胞粘附介导的耐药性有助于将血液系统恶性肿瘤的残留疾病和复发降至最低。在这里，我们发现Jurkat T急性淋巴细胞白血病细胞与α4β1-整合素或α5β1-整整素结合的底物的粘附促进了对阿霉素诱导的凋亡的化疗耐药性。α4δ（一种截短的α4整合素，以KXGFFKR为细胞质基序）在α4缺陷细胞中的重组表达以不依赖于α4介导的粘附的方式促进了对阿霉素的化疗耐药性。粘附非依赖性化疗耐药性不需要β1-整合素作为异二聚体对，因为Tacδ（一种融合到膜旁KXGFFKR的单体非整合素跨膜蛋白）的表达足以重现这种现象。表达α4δ和Tacδ的细胞不需要整合素介导的粘附来刺激Akt磷酸化和活化。表达α4δ和Tacδ的细胞表现出细胞外Ca（2+）的大量内流，维拉帕米抑制Ca（2+）通道可减弱粘附非依赖性的化疗耐药性。Tacδ细胞也表现出更高的药物流出率。α4δ和Tacδ以依赖于KXGFFKR基序的方式与Ca（2+）结合蛋白钙网蛋白相互作用。与非粘附细胞相比，α4-整合素的粘附介导的结合促进了钙网蛋白-α4的结合增加和细胞外Ca（2+）的大量流入。α-整合素KXGFFKR基序参与粘附介导的T细胞化疗耐药性的控制。

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数字

图1
整合素底物上的粘附使Jurkat T细胞对阿霉素产生耐药性。（A）将Jurkat T细胞置于涂有GST-CS1、GST-Fn9.11或GST的培养皿上，不处理或用0.05μg/ml阿霉素处理48小时。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合，绘制的数据是凋亡细胞的百分比。数据为平均值±标准偏差(n个= 3). *,*P（P）*< 0.001. （B）将JB4（缺乏α4）或JB4-α4（用α4表达重组）细胞置于GST-CS1涂层的培养皿上，不处理或用0.03或0.06μg/ml的阿霉素处理48小时。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合，绘制的数据是凋亡细胞的百分比。数据为平均值±标准偏差(n个= 3). *,*P（P）*< 0.02; **,*P（P）*< 0.05.

图2
α4尾流变体α4δ的表达以非粘附性的方式增强了化疗耐药性。（A，顶部）所用α4-整合素结构的示意图，突出显示细胞质域序列。如图所示，α4δ被截断，并保留细胞质尾部的KAGFFKR部分。胞外结构域；TMD，跨膜结构域。（底部）流式细胞术测定Jurkat、JB4、JB4-α4和JB4-α4δ细胞中细胞表面α4-整合素和β1-整合素的表达。直方图下的数字是MFI（荧光强度中值）。（B）在涂有GST-CS1、GST-Fn9.11或GST的培养皿上培养JB4-α4、JB4-α4-δ和JB4细胞30分钟，并按照粘附细胞与非粘附细胞的材料和方法进行评分。绘制的数据是粘附细胞的平均百分比，根据每种细胞类型和治疗条件的12个FOV计算得出（平均值±标准偏差；n个=12 FOV）。*，*P（P）*< 0.0001. （C）将JB4-α4、JB4-α4-δ和JB4细胞置于涂有GST-CS1、GST-Fn9.11或BSA的培养皿上，不处理或用0.03μg/ml阿霉素处理48小时。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合（平均值±标准偏差；n个= 3). *,*P（P）*< 0.02; 不另作说明，不重要。

图3
α-整合素尾部膜近端GFFKR基序的表达以粘附无关的方式增强了化疗耐药性。（A，顶部）与α4和α4δ相比，表达载体表位Tac的细胞外和跨膜结构域的其他融合构建物示意图。Tacδ和Tacδ^可控硅分别是Tac与细胞质肽KLGFFKR和扰乱版本KLRFGFK的融合。（底部）流式细胞术测定JB4、JB4-Tacδ和JB4-Tacδ中细胞表面Tac和整合素-β1的表达^可控硅细胞。直方图下的数字是MFI（刻度，0.1×）。（B） JB4、JB4-α4、JB4-α4δ、JB4-Tacδ、JB4-Tacδ^可控硅将细胞置于GST涂层培养皿上，用0.03μg/ml阿霉素处理48小时。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合，绘制的数据是凋亡细胞的百分比（平均值±标准偏差；n个= 3). *,*P（P）*< 0.03; **,*P（P）*< 0.01.

图4
α4δ和Tacδ的表达绕过了细胞粘附介导的Akt磷酸化和活化刺激的要求。（A）将JB4或JB4-α4细胞在涂有GST-CS1或GST的培养皿上培养指定时间，并对细胞裂解物进行免疫印迹检测T308-磷酸化Akt（pAkt）和总Akt水平。（B） JB4-Tacδ，JB4-Tacδ^可控硅在涂有GST-CS1、GST-Fn9.11或BSA的培养皿上培养JB4、JB4-α4δ和JB4-α4-细胞45分钟，并用细胞裂解物进行免疫印迹检测pAkt和总Akt水平。（C） JB4-Tacδ和JB4-Tacδ^可控硅将细胞置于涂有GST-Fn9.11（粘附+ve）或GST（粘附-ve）的培养皿上45分钟，并对细胞裂解物进行免疫印迹检测T308-或S473-磷酸化Akt（pAkt）和总Akt水平。（D） JB4-Tacδ和JB4-Tacδ的裂解物^可控硅细胞被印迹以检测Akt-磷酸化底物和GAPDH。Akt活化指数计算为Akt磷酸化底物的总荧光除以GAPDH活性（平均值±标准偏差；3个独立实验）。*，*P（P）*< 0.05. （E）将Jurkat细胞的裂解液涂布在涂有BSA或纤维连接蛋白的培养皿上30分钟，用印迹法检测Akt-磷酸化底物和GAPDH，如面板D所述。数据绘制为Akt活化指数（平均值±标准偏差；3个独立实验）。*，*P（P）*< 0.03. （F） JB4-Tacδ和JB4-Tacδ^可控硅以指示浓度用Akt抑制剂IV处理细胞48 h。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合率，将数据绘制为凋亡细胞百分比（平均值±标准偏差；n个= 3). *,*P（P）*< 0.02; ns，不显著。

图5
阻断L型钙通道可减弱对阿霉素的耐药性。（A）细胞内钙²⁺通过流式细胞术测量JB4衍生细胞系。按照材料和方法中的描述，用Fluo-4-AM标记所示的细胞，清洗掉染料，并在PBS中用或不用1mM CaCl重新悬浮₂测量前，在22°C下保持10分钟。绘制的数据是从1 mM CaCl中获得的细胞内钙测量值₂–单独使用PBS从荧光中减去PBS（平均值±标准偏差；n个= 4). *,*P（P）*<0.01。（B） JB4-Tacδ和JB4-Tacδ^可控硅用0.04μg/ml阿霉素和/或0.6 mM EGTA联合处理细胞48小时。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合，绘制的数据是凋亡细胞的百分比（平均值±标准偏差；n个= 4). *,*P（P）*< 0.001. （C）细胞内Ca的Fluo-4-AM荧光测量²⁺在JB4 Tacδ和JB4 Tacδ中^可控硅与细胞外1mM Ca的组合孵育的细胞²⁺和/或0.6 mM EGTA（平均值±标准偏差；n个= 3). *,*P（P）*< 0.03. （D） JB4-Tacδ和JB4-Tacδ^可控硅用0.03μg/ml阿霉素和/或60μM维拉帕米联合处理细胞48小时。根据流式细胞术测定Cy5-annexin V结合（平均值±标准偏差；n个= 3). *,*P（P）*< 0.002; **,*P（P）*< 0.0001. （E）细胞内钙的Fluo-4-AM荧光测量²⁺在JB4-Tacδ和JB4-Tacδ中^可控硅用1 mM Ca培养的细胞²⁺和0.6 mM EGTA或60μM维拉帕米（平均值±标准偏差；n个= 3). *,*P（P）*< 0.001.

图6
细胞粘附促进细胞内钙的增加²⁺将等分的Fluo-4-AM标记的Jurkat细胞接种到涂有CS1、纤维连接蛋白（Fn）或BSA的培养皿中，细胞外培养基中添加或不添加EGTA。在细胞接种后的指定时间测定Fluo-4-AM荧光。绘制的数据为平均值±标准偏差(n个=5个重复井）。*P（P）*<0.01t吨Fn与BSA之比为20至35分钟；对于t吨=0至15分钟。

图7
GFFKR表达对药物外排的影响。（A） JB4-Tacδ和JB4-Tacδ^可控硅细胞与细胞渗透性钙黄绿素AM底物孵育，并在指定时间进行荧光测量。非荧光钙黄绿素AM被胞内酯酶水解为高荧光钙黄黄素；因此，钙黄绿素累积率是钙黄绿素AM细胞外排率的间接和反向测量。绘制的数据是4个重复井的平均值±标准偏差。ns，对于t吨=0至2分钟；*P（P）*<0.002t吨>5分钟（B）JB4-Tacδ和JB4-Tacδ^可控硅细胞与高剂量阿霉素孵育，洗净，再悬浮在含有或不含（+）1 mM Ca的PBS中²⁺在指定的时间，评估无细胞上清液的荧光，作为阿霉素从细胞流出的指示。最早时间点的采样时间估计为5分钟。绘制的数据是3份重复细胞等分试样的平均值±标准偏差。*，*P（P）*<0.009；ns，不显著。

图8
钙网蛋白通过GFFKR基序与α4和Tacδ相互作用。（A） JB4-α4、JB4-α4-δ、JB4、JB4-Tacδ和JB4-Tacδ裂解产物中CRT总表达的比较^可控硅Western blotting检测细胞。通过免疫印迹法评估GAPDH的等蛋白载量。（B）使用基质固定化GST-KLGFFKR和GST-KLRFGFK（打乱）重组蛋白与Jurkat细胞裂解物孵育的亲和层析。用Western blotting检测CRT的结合情况。考马斯蓝染色观察GST重组蛋白的负载情况。（C）用α4表面表位抗体或IgG对照物对JB4-α4、JB4-α4-δ和JB4细胞制备的裂解液进行免疫沉淀（IP），并用CRT和α4抗体检测相关蛋白。（D）由JB4-Tacδ和JB4-Tacδ制备的裂解液^可控硅用Tac表面表位抗体免疫沉淀细胞，用CRT和Tac抗体检测相关蛋白。（E）将Jurkat细胞制备的裂解液涂布在指定底物上45分钟，然后用α4表面表位抗体进行免疫沉淀；用CRT和α4抗体进行印迹检测相关蛋白。

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