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.2013;9（8）：e1003705。
doi:10.1371/journal.pgen.1003705。 Epub 2013年8月22日。

内含子长非编码RNA ANRASSF1将PRC2招募到RASSF1A启动子，减少RASSF1A的表达并增加细胞增殖

费利佩·贝克多夫 1, 安娜·C·阿尤佩, 雷南·克罗奇-苏扎, 穆里洛·阿马拉尔, 海尔德一世中谷, Daniela T Soltys公司, 卡洛斯·F·M·门克, 爱德华多·梅莱斯, 塞尔吉奥·维尔乔夫斯基-阿尔梅达
附属公司

内含子长非编码RNA ANRASSF1将PRC2招募到RASSF1A启动子，减少RASSF1A的表达并增加细胞增殖

费利佩·贝克多夫等。 公共科学图书馆-基因. 2013.

摘要

肿瘤抑制基因RASSF1A的下调已被证明可增加几种肿瘤的细胞增殖。RASSF1A的表达通过涉及多梳抑制复合物2（PRC2）的表观遗传事件进行调节；然而，调控RASSF1基因座的表观遗传修饰物募集的分子机制仍不清楚。在这里，我们鉴定并表征了ANRASSF1，一种内源性非片段长非编码RNA（lncRNA），它是从多个细胞系和组织中RASSF1基因位点的相反链转录而来，并与PRC2结合。ANRASSF1通过RNA聚合酶II转录，具有5'端和多聚腺苷化；与其他结合PRC2的lncRNA相比，它表现出核定位，半衰期较短。与非肿瘤细胞相比，ANRASSF1内源性表达在乳腺和前列腺肿瘤细胞系中更高，RASSF1A则相反。ANRASSF1异位过度表达降低了RASSF1A的丰度并增加了HeLa细胞的增殖，而ANRASSF1-沉默则产生相反的效果。ANRASSF1水平的这些变化不会影响RASSF1C同种型的丰度。ANRASSF1过度表达导致PRC2占用和组蛋白H3K27me3抑制标记显著增加，特别是在RASSF1A启动子区。在RASSF1C启动子区和其他四个相邻基因（包括两个特征良好的肿瘤抑制基因）的PRC2占有率和组蛋白H3K27me3上，未检测到ANRASSF1过度表达的影响。此外，我们证明ANRASSF1形成RNA/DNA杂交，并将PRC2招募到RASSF1A启动子。总之，这些结果证明了一种新的RASSF1A抑癌基因表观遗传抑制机制，该机制涉及反义非片段lncRNA，其中ANRASSF1以位置特异的方式选择性抑制与反义转录物重叠的RASSF1亚型的表达。从更广泛的角度来看，我们的研究结果表明，在人类基因组中转录的其他非特征性非片段化内含子lncRNA可能有助于基因的位置特异性表观遗传调控。

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数字

图1
图1。反义非编码RNAANRASSF1公司在RASSF1系统基因组位点与RASSF1系统表达式。
（A） 整体示意图RASSF1位点显示在顶部。蛋白质编码RASSF1系统基因亚型（RefSeq注释）以黑色显示；ANRASSF1公司来自公共无害环境技术大会的证据显示为浅灰色；延伸至5′端RACE和primer-walking或3′端RACE的部分显示为红色，通过测序检测到poly（a）片段。箭头定义序列的方向。（B）ANRASSF1公司在多个人类细胞系中使用终点PCR在反义（AS）而非与蛋白编码基因相关的义（S）方向检测到。链特异性引物用于逆转录（RT）（上的短半箭头数字2和3ANRASSF1公司面板A中）。采用无引物的RT反应作为阴性对照（Ctl）。编号为1和4的短半箭头表示终点PCR所用的引物。（C） LNCaP细胞poly（A）+RNA的链特异性RNA-seq。The abundance of the reads mapping within theRASSF1系统基因组基因座显示在图中，并且颜色对应于转录物的DNA链。红色横条表示从RNA-seq读取映射到该位点正链的集合中的一致序列，该序列是使用袖扣工具生成的。灰色条表示全长ANRASSF1公司通过RACE-PCR和Sanger测序获得。箭头定义序列的方向。（D） 的表达式RASSF1系统和ANRASSF1公司使用来自GSE5823的HeLa、MDA-MB-231和MCF-7细胞中的Affymetrix微阵列进行测量。（E） 的表达式RASSF1系统和ANRASSF1公司用Affymetrix微阵列检测GSE11118中佛波酯和离子霉素处理30和60分钟后诱导的Jurkat细胞有丝分裂应激。
图2
图2。之间的反向相关性ANRASSF1公司和RASSF1A公司在非肿瘤和肿瘤细胞系中表达。
的表达式ANRASSF1公司和，共RASSF1A公司在（A）乳腺细胞系和（B）前列腺细胞系中。对肿瘤细胞系（白色条）和非肿瘤永生化细胞系（阴影条）进行了测试。这些数据显示了每个细胞系两个或三个独立生物复制的平均值±SD。将肿瘤中的表达值与非肿瘤细胞系中的表达进行比较。这些数据是相对于HPRT1型表达式。
图3
图3。的过度表达ANRASSF1公司减少蛋白质编码RASSF1A公司亚型。
（A） 的表达式ANRASSF1公司在HeLa细胞中转染ANRASSF1型-包含向量（pCEP4ANRASSF1公司)与…相比ANRASSF1公司用空载体（空pCEP4）转染的对照HeLa细胞中的表达。RT-qPCR检测相对表达；这些数据是相对于α-微管蛋白绘制的。这些数据显示了三个独立复制转染实验的平均值±SD*第页与对照组相比<0.01。（B） 的相对表达式RASSF1A公司异构体ANRASSF1公司-转染细胞和对照细胞，如（A）所述。这些数据显示了三个独立转染实验的平均值±SD*第页与对照组相比<0.01。（C） 的相对表达式RASSF1C公司异构体ANRASSF1公司-转染细胞和对照细胞，如（A）所述。这些数据显示了三个独立转染实验的平均值±SD。（D） 使用从对照HeLa细胞（空pCEP4）或ANRASSF1公司-转染细胞（pCEP4ANRASSF1型). 以肌动蛋白抗体作为对照。（E） 来自三次重复分析的RASSF1A蛋白印迹信号的密度分析。RASSF1A的相对蛋白水平归一化为肌动蛋白。这些数据显示了三个独立转染实验的平均值±SD*第页<0.02。
图4
图4。的过度表达ANRASSF1公司增加细胞生长，减少UVC和staurosporine介导的细胞死亡。
（A） 细胞增殖系数ANRASSF1型-转染细胞（pCEP4ANRASSF1公司)相对于对照细胞（空pCEP4），如使用MTS分析测量。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD*t吨-测试第页<0.03（相对于对照）。（B） 的影响ANRASSF1公司过度表达对细胞群体增长的影响，通过计算培养过程中细胞的数量并计算群体倍增时间来测量。这些数据显示了两个独立实验的平均值±SD，一式三份*t吨-测试第页<0.05. （C） DNA含量直方图显示了ANRASSF1公司暴露于UVC照射后48小时细胞周期过度表达（40 J/m2). 用碘化丙啶标记细胞。浅灰色表示亚G1群体。（D） 子G的百分比1实验中的种群与（C）相同。这些数据显示了三个独立重复实验的平均值±SD*t吨-测试第页与对照组相比<0.05。（E） 的影响ANRASSF1公司细胞毒药物staurosporine（100 nM）存在时对细胞存活的过度表达。使用xCELLigence系统测量阻抗变化，以连续监测细胞与培养板的粘附。两种情况下的三个独立生物复制（pCEP4ANRASSF1公司或空pCEP4），每个代表两个或三个技术复制的平均值±SD；红线显示细胞过度表达ANRASSF1公司，蓝线显示携带空pCEP4）载体的控制细胞*t吨-测试第页<0.001，对于170小时的细胞指数。
图5
图5。ANRASSF1公司击倒会增加RASSF1A公司亚型表达并降低细胞增殖。
（A） 的表达式级别ANRASSF1公司在用siRNA处理的细胞中ANRASSF1公司相对于ANRASSF1公司在用干扰siRNA（siRNA控制）处理的对照细胞中。使用归一化为α-微管蛋白的RT-qPCR检测相对表达。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD*第页与对照组相比<0.01。（B） 的相对表达水平RASSF1A公司在siRNA中ANRASSF1公司细胞和siRNA控制细胞，如（A）所述。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD*第页与对照组相比<0.01。（C） 的相对表达水平RASSF1C公司在siRNA中ANRASSF1公司细胞和siRNA控制细胞，如（A）所述。（D） siRNA的细胞增殖系数ANRASSF1公司细胞相对于对照细胞（siRNA对照）。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD*第页相对于对照组<0.02。
图6
图6。ANRASSF1公司与PRC2相互作用并影响其在RASSF1A公司发起人。
（A） 内源性ANRASSF1公司与PRC2结合的水平通过RNA IP和抗SUZ12相对输入在HeLa细胞中测量。同时进行带有非特异性IgG的对照IP。作为阴性对照，GAPDH公司使用了不期望与PRC2结合的mRNA。IP部分的输入百分比显示为ANRASSF1公司/GAPDH公司比率。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。（B） lincRNA S首件鉴定是与PRC2结合的阳性对照；RNA IP的测定如（A）所示。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。（C） 在HeLa细胞过度表达中使用抗SUZ12抗体进行ChIP检测ANRASSF1公司（pCEP4）ANRASSF1公司，黑色条）或控制单元格（空pCEP4，白色条）。的启动子区域RASSF1A公司和RASSF1C公司亚型和两个其他基因RASSF1系统对chr3上的基因座进行了研究（在图的底部所示的方案中，启动子用垂直线表示）。控制GAPDH公司作为一个不希望通过SUZ12调节的基因被包括在内。控制HOXA9型是一个通过SUZ12调节并编码在chr 7上的基因。通过qPCR分析检测到的每个启动子区的抗SUZ12样本中的DNA数量与输入量有关。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD*t吨-测试第页<0.02相对于控制RASSF1A公司基因座。其他位点未检测到显著变化。（D） 使用抗H3K27me3抗体在类似于（C）中所述的分析中进行ChIP分析，但富集是相对于抗H3 ChIP计算的。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD*t吨-测试第页在RASSF1A公司基因座。其他位点未检测到显著变化。（E） 在类似于（C）所述的分析中使用抗DNMT3B抗体进行ChIP分析。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。未观察到明显变化。（F） DNA甲基化RASSF1A公司用甲基化依赖性McrBC核酸内切酶分析法通过qPCR检测启动子区域ANRASSF1公司-过表达或对照细胞。比较McrBC核酸内切酶处理后qPCR扩增的DNA数量与无核酸酶处理后的DNA数量后，计算DNA剩余百分比。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。未观察到明显变化。
图7
图7。ANRASSF1公司调解SUZ12的招募RASSF1A公司发起人。
（A） 核糖核酸酶检测ANRASSF1公司对经RNase抑制剂（黑条）、RNase H（红条）或RNase A（蓝条）处理的渗透性HeLa细胞进行RT-qPCR。相对于RNase抑制剂的相应值，计算两个RNase处理中每个处理的RNA%。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。（B） 作为对照，在与（a）所述相同的条件下，使用RT-qPCR平行测量α-管蛋白mRNA。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。（C） 用抗SUZ12抗体对经RNase抑制剂（黑条）、RNase H（红条）或RNase A（蓝条）处理的渗透性HeLa细胞进行RNase-ChIP分析。DNA的数量RASSF1A公司通过qPCR在抗SUZ12样本中检测到的启动子区域根据输入进行计算。这些数据显示了两个独立实验（一式三份）的平均值±SD。（D） DNA的数量RASSF1C公司在与（C）所述相同的条件下测量启动子区域。（E–F）RASSF1A公司和RASSF1C公司在与（C–D）相同的条件下测量启动子区域，但使用了抗DNMT3B抗体。（G–H）RASSF1A公司和RASSF1C公司在与（C–D）中相同的条件下测量启动子区域，不同之处在于使用抗RNA Pol II抗体。
图8
图8。PRC2由ANRASSF1公司lncRNA到RASSF1A公司发起人。
（A） 在转染RNAi寡核苷酸反义的HeLa细胞中使用抗SUZ12抗体进行ChIP检测ANRASSF1公司或者用一个对照的打乱的寡核苷酸。DNA的数量RASSF1A公司使用qPCR在抗SUZ12样本中检测到的启动子区域根据输入进行计算。这些数据显示了一式三份的两个独立实验的平均值±SD*第页<0.03（相对于对照）。（B） 在类似于（A）的分析中使用抗DNMT3B抗体进行ChIP分析。（C） DNA甲基化RASSF1A公司在甲基化依赖性McrBC核酸内切酶检测中，通过qPCR检测转染RNAi反义寡核苷酸的细胞中的启动子区域ANRASSF1公司或者用一个对照的打乱的寡核苷酸。剩余DNA的百分比是通过比较RASSF1A公司McrBC内切酶处理后通过qPCR扩增，而非核酸酶处理后扩增。这些数据显示了三个独立实验的平均值±SD。未观察到明显变化。
图9
图9。的建议模型ANRASSF1公司功能位于RASSF1系统基因组学轨迹.
我们假设lncRNAANRASSF1型（蓝线）在转录位点与基因组DNA相互作用，形成RNA/DNA杂交，并将染色质修饰的PRC2复合物用于蛋白质编码RASSF1A公司基因启动子区。PCR2复合物的募集导致组蛋白H3K27甲基化模式的选择性修饰（红圈）RASSF1A公司促进剂，导致RASSF1A公司转录活性对RASSF1C公司转录。
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赠款和资金

这项工作得到了圣保罗国家科学基金会（FAPESP）（SVA和EMR）和国家癌症技术研究所（SVA和EMR）的资助，以及圣保罗国家科学基金会（FCB、RCS、HIN、DTS、ACA）和国家癌症技术委员会（CNPq）（MSA）的研究金的支持以及研究人员奖学金（CNPq）（SVA、CFMM和EMR）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。