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.2013年8月13日；8（8）：e71869。
doi:10.1371/journal.pone.0071869。 2013年电子收集。

哺乳动物呼吸链复合物的高分子量形式II

尼古拉·科瓦奥娃 1, 汤姆亚什亚切克先生, 哈纳·Nůsková, 埃利什卡·霍尔泽罗娃, 马雷克·弗巴克（Marek Vrback）, 彼得·佩西纳, 凯特·伊娜·海兹拉罗娃, 卡塔琳娜·库奇科娃, 雅库布·罗莱纳, 吉里·纽齐尔, 约瑟夫·侯赛克
附属公司

哺乳动物呼吸链复合物的高分子量形式II

尼古拉·科瓦奥娃等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

线粒体呼吸链被组织成超分子结构，可以保存在温和的洗涤剂溶液中，并通过天然电泳系统进行解析。呼吸复合物I、III和IV的超复合体以及ATP合成酶的多聚体形式已经得到了很好的确定。然而，线粒体超复合体中连接呼吸链和三羧酸循环的复合体II的参与值得怀疑。在这里，我们表明，洋地黄素固溶复合物II定量地形成了高分子量结构（CIIhmw），可以通过清晰的天然电泳进行解析。CIIhmw结构具有酶活性，组织（500-1000 kDa以上）和培养细胞（400-670 kDa）之间的电泳迁移率不同。虽然它们的形成不受其他呼吸链复合物中孤立缺陷的影响，但在mtDNA缺失的rho0细胞中，它们不稳定。负责CIIhmw组装的分子相互作用很弱，复合物在组织中比在培养细胞中更稳定。虽然CIIhmw的电泳研究和免疫沉淀实验没有表明与呼吸链复合物I、III或IV或三羧酸循环酶的特定相互作用，但它们指出CII和ATP合成酶之间的特定交互作用。

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数字

图1
图1。高分子量形式的络合物II。
用洋地黄素（4 g/g蛋白）溶解来自对照成纤维细胞和大鼠心脏的线粒体膜蛋白，并使用BNE、hrCNE3和CNE分离20µg蛋白等分。用SDHA抗体（A，D）和SDHB抗体（B，E）免疫检测CII。在CNE凝胶（C，F）中对CII进行In-gel活性染色。CII（CII）高分子量形式的迁移嗯)，CII单体（CII米)标记CII的SDHA和SDHB亚单位。这些图像代表了三个独立的实验。
图2
图2。OXPHOS蛋白的CNE/SDS PAGE分析。
从人成纤维细胞（A）和大鼠心脏（B）线粒体中提取的洋地黄素可溶性蛋白通过CNE第一维度（40µg蛋白质负载）和SDS-PAGE第二维度分离。使用特异性抗体免疫检测呼吸链CI（NDUFA9）、CII（SDHA、SDHB）、CIII（Core1）、CIV（Cox4）和CV（α）的亚单位。western印迹下方分布图中的垂直虚线描绘了高分子量形式的复合物II（CII嗯).
图3
图3。CII比较嗯western印迹和凝胶内活性染色。
用洋地黄素（4 g/g蛋白质）溶解来自不同人类和啮齿动物细胞（A）和组织（B）的线粒体，并使用CNE分离20µg蛋白质等分。用SDHA抗体对CII进行免疫检测。CNE凝胶中CII（紫色）、CIV（棕色）和CV（白色）的活性（细胞蛋白质负荷50µg，组织蛋白质负荷40µg）显示在人类成纤维细胞（C）和大鼠心脏（D）中。CII（CII）的高分子量形式的位置嗯)，CII单体（CII米)，CIV二聚体（CIVD类)及其超复合体（CIV联合国安全理事会)，CV二聚体（CVD类)和四聚体（CVT型)如图所示。大鼠BAT，大鼠棕色脂肪组织。
图4
图4。CII的存在嗯在不同类型OXPHOS缺陷和ρ的人成纤维细胞中0细胞。
通过CNE（20µg蛋白质负荷）分析洋地黄素溶解的线粒体复合物，并使用单个亚单位的抗体进行免疫检测：（A）CII，SDHA；（B） CIV，Cox1；（C） CV，α亚单位。CII单体的位置（CII米)，CII的高分子量形式（CII嗯)，CIV二聚体（CIVD类)，CIV的超复合体（CIV联合国安全理事会)，F1CV（F）的次复形1Sub.），CV的单体、二聚体和四聚体（CV米，简历D类和简历T型)以及缺乏mtDNA编码亚单位（CV）的CV二聚体和四聚体D类*和简历T型*)已标记。
图5
图5。CII稳定性低嗯在成纤维细胞中。
（A） 来自对照人类成纤维细胞或对照小鼠成纤维细胞的洋地黄素可溶性（4 g/g蛋白质；20µg蛋白质负荷）线粒体蛋白质通过CNE与（+）或不与（-）CBG溶解。（B–F）二维CNE/CNECBG公司对照组成纤维细胞线粒体蛋白分析（50µg蛋白负荷）。用CNE分离线粒体蛋白后，将凝胶切片在CBG中孵育，然后进行第二维CNE。一个凝胶用考马斯蓝染色，相同的重复凝胶用于western blot。根据免疫检测，单个OXPHOS复合物的位置在染色凝胶（B）上突出显示：全白线，CII单体（CII米); 红色虚线，CIV二聚体（CIVD类)和CIV（CIV）的超复合体联合国安全理事会); 全黑线，F1CV（F）的次复形1和CV（CV）单体米)基于SDHA（C）、SDHB（D）、Cox1（E）和CV-α（F）亚单位的信号。
图6
图6。CII稳定性低嗯在老鼠的心脏里。
（A） 大鼠心脏线粒体中的洋地黄素可溶性（4 g/g蛋白质，20µg蛋白质负荷）线粒体蛋白质由CNE用（+）或不用（-）CBG溶解。（B–F）二维CNE/CNECBG公司大鼠心脏线粒体蛋白质分析（40µg蛋白质负荷）。用CNE分离线粒体蛋白后，将凝胶切片在CBG中孵育，然后进行第二维CNE。一个凝胶用考马斯蓝染色，相同的重复凝胶用于western blot。根据免疫检测，单个OXPHOS复合物的位置在染色凝胶（B）上突出显示：全白线，CII单体（CII米)，CII的高分子量形式（CII嗯)和CII的SDHA亚单位；红色虚线，CIV二聚体（CIVD类)和CIV（CIV）的超复合体联合国安全理事会); 全黑线，F1CV（F）的次复形1和CV（CV）单体米)基于SDHA（C）、Cox1（D）和CV-α（E）亚单位的信号。
图7
图7。CII和CV共同免疫沉淀。
大鼠心脏线粒体（A）和人成纤维细胞（B）的洋地黄素溶解后，CV用其F抗体免疫沉淀1带有抗SDHA的部件和CII。用SDS-PAGE分离免疫沉淀（IP）和可溶性（S）中的蛋白质，并用CI、NDUFA9抗体检测OXPHOS复合物的单个亚单位；CII、SDHA；CIII，核心2；CIV，Cox4；CV，α，γ，a。
图8
图8。CII与TCA循环的其他组件无关。
（A） 用洋地黄素（4 g/g蛋白）和用CNE分离的20µg蛋白等分液溶解大鼠心脏线粒体膜蛋白。用特异性抗体检测CII的SDHA亚基（CII）、富马酸酶（FH）和琥珀酰辅酶A合成酶（SUCL）的α亚基。（B） 大鼠心脏线粒体洋地黄苷溶解后，用抗SDHA抗体（SDHA抗血清）免疫沉淀CII。用SDS-PAGE分离免疫沉淀物（IP）和可溶性物（S）中的蛋白质，并分析TCA循环的单个成分：α-酮戊二酸脱氢酶亚基E1、KGDH（E1）；乌头糖；CII、SDHA；富马酸酶，FH；柠檬酸合酶；异柠檬酸脱氢酶亚单位α，IDH（α）；琥珀酰辅酶A合成酶（亚单位α），SUCL（α）；苹果酸脱氢酶。
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