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.2013年10月；24(19):3115-22.
doi:10.1091/mbc。E12-10-0765。 Epub 2013年8月21日。

3T3-L1细胞中葡萄糖转运蛋白4的胰岛素反应性取决于sortilin的存在

黄冠荣 1, 达娜·巴克勒-佩纳, 泰萨·诺塔, 曼尼特·辛格, 阿格尼斯·阿斯玛, 史骏, 朱友金（Ju Youn Kim）, 康斯坦丁V·坎德罗
附属机构

3T3-L1细胞中葡萄糖转运蛋白4的胰岛素反应性取决于分拣素的存在

黄冠荣等。 分子生物学细胞. 2013年10月.

摘要

胰岛素依赖性葡萄糖转运蛋白4（Glut4）向脂肪和骨骼肌细胞质膜的移位在餐后血糖清除中起关键作用。谷氨酸4代表胰岛素反应小泡（IRV）的主要细胞特异性成分。然而，目前尚不清楚IRV中是否存在谷氨酸4对其对胰岛素刺激反应的能力至关重要。我们制备了两株低表达和高表达myc7-Glut4的3T3-L1细胞系，并利用荧光辅助细胞分选和细胞表面生物素化研究了其在胰岛素刺激下向质膜的移位。在未分化的3T3-L1前脂肪细胞中，无论其表达水平如何，myc7-Glut4的易位都很低。sortilin的共表达增加了myc7-Glut4对IRV的靶向性，其胰岛素反应性上升到全分化脂肪细胞中观察到的最大水平。无论是否存在myc7-Glut4，在未分化细胞中外源性表达的Sortilin都会转移到质膜上。AS160/TBC1D4在前脂肪细胞中低水平表达，但在分化过程中被诱导，为细胞内滞留和胰岛素刺激的谷氨酸释放提供了额外的机制。

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数字

图1：
图1：
Sortilin在未分化的3T3-L1前脂肪细胞外周表达，定位于IRV-like囊泡中，并在胰岛素刺激下转移到细胞表面。（A） 将未分化和分化的3T3-L1细胞均质化，并用抗索替林抗体进行Western blotting分析总细胞裂解物（40μg）。以亲环素A为负荷对照。虚线表示无关车道已拼接。三个独立实验的代表性结果。（B） 将未分化的S前脂肪细胞和分化的野生型3T3-L1脂肪细胞均化并在27000×克持续35min，用连续蔗糖梯度离心法分离上清液（总蛋白1mg）。箭头指示沉积方向。至少10个独立实验的代表性结果。（C） 未分化的S前脂肪细胞用磺化NHS-S-S生物素进行生物素化，并使用链霉亲和素琼脂糖从100–140μg总细胞裂解液中分离生物素化蛋白，并通过Western blotting以及总裂解液和未结合物质（各40μg）进行分析。四个独立实验的代表性结果。（D） 未分化空载体（EV）感染和S前脂肪细胞用7 nM培养[三H] 在指定的时间段内使用神经降压素，按照材料和方法，并在闪烁计数器中计数。三个实验的归一化平均值±SEM。
图2：
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体外表达myc的分室化7-未分化前脂肪细胞中的谷蛋白4。（A） 表达低水平myc的未分化和分化细胞7-谷氨酸4（LG），高水平myc7-谷蛋白4（HG）或两者myc7-将Glut4和sortilin myc/His（GS）匀浆，并通过蛋白质印迹分析总细胞裂解物。使用纤维素吡啶和3-磷酸甘油醛脱氢酶作为负荷控制。（B） myc的量化7-根据三个独立实验，A中显示了谷氨酸信号*第页< 0.05, **第页< 0.01. （C） 对未分化的LG、HG和GS前脂肪细胞进行均质化，并在27000×克35分钟。上清液通过200000×离心造粒克90分钟，用蛋白质印迹法和27000×等分样品进行分析克颗粒。三个独立实验的代表性结果。（D） 对未分化的HG和GS前脂肪细胞进行均质化，并在27000×克在SW55转子中以48000 rpm的速度连续蔗糖梯度离心55 min，对上清液进行分析。箭头指示沉积方向。含myc的分数7-来自HG和GS前脂肪细胞的谷氨酸4被转移到相同的膜上，同时进行处理，因此彼此之间具有直接的可比性。至少四个独立实验的代表性结果。
图3：
图3：
外源表达myc的易位7-未分化和分化3T3-L1细胞中的谷蛋白4。未分化（Fb）和分化5–7天（Ad）细胞用胰岛素处理（+）或不处理（-）15分钟（A–E）。用抗myc抗体对代表性细胞进行免疫荧光染色。（F–I）myc移位7-通过荧光辅助细胞分选分析谷氨酸4，如材料和方法每一个都是至少两个独立实验的代表性结果。
图4：
图4：
外源表达myc的易位7-通过细胞表面生物素化在未分化前脂肪细胞中的谷蛋白4和sortilin-myc/His。未分化的前脂肪细胞用磺化NHS生物素进行生物素化，用免疫沉淀法分离myc标记蛋白并用Western blotting进行分析。三个独立实验的代表性结果。
图5：
图5：
AS160/TBC1D4是在3T3-L1细胞分化时诱导的，是myc细胞内隔离所必需的7-谷氨酸4。（A）未分化和分化3T3-L1细胞中蛋白质的表达。两个独立实验的代表性结果。（B） 如图所示，用GFP cDNA单独或GFP和AS160/TBC1D4的cDNA混合物电穿孔GS前脂肪细胞。48小时后，用胰岛素处理或不处理细胞15分钟，并用myc表位抗体进行免疫染色，但不进行渗透。左侧，代表性单元格。右，随机选择的GFP阳性细胞中myc阳性细胞的百分比（每个区域35-56个细胞）。三个实验的代表性结果。（C） GS前脂肪细胞转染AS160/TBC1D4和6-P突变体的cDNA，使用Lipofectamine 2000。48小时后，用胰岛素处理或不处理细胞15分钟并收获，用Western blotting分析总细胞裂解物（40μg）。三个独立实验的代表性结果。（D） 如Lipofectamine 2000所示，GS前脂肪细胞单独转染GFP cDNA或与GFP和6-P突变体的cDNA混合物转染。48小时后，用胰岛素处理或不处理细胞15分钟，并用myc表位抗体进行免疫染色，但不进行渗透。左侧，代表性细胞。对，随机选择的GFP阳性细胞中myc阳性细胞的百分比。三个实验的代表性结果，计算了286–299个胰岛素处理和未处理细胞*第页< 0.05, **第页< 0.01.
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