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.2013年10月4日；288(40):29105-14.
doi:10.1074/jbc。M113.510933。 Epub 2013年8月19日。

FRAX597是p21激活激酶的小分子抑制剂，抑制神经纤维瘤病2型（NF2）相关神经鞘瘤的肿瘤发生

西尔维娅·利奇乌利 1, 贾斯娜·马克西莫斯卡, 春洲, 斯科特·特劳特曼, 斯米莎·科塔, 秦柳, 塞尔吉奥·杜龙, 大卫·坎贝尔, 乔纳森·切尔诺夫, 杰弗里·菲尔德, 罗恩·马尔莫斯坦, 约瑟夫·基西尔
附属公司

FRAX597是p21激活激酶的小分子抑制剂，抑制神经纤维瘤病2型（NF2）相关神经鞘瘤的肿瘤发生

西尔维娅·利奇乌利等。 生物化学杂志. .

摘要

p21活化激酶（PAK）是Rac/Cdc42小G蛋白的直接下游效应器，与促进各种癌症（包括乳腺癌和肺癌）的肿瘤发生有关。最近的研究确定了PAK在2型神经纤维瘤病（NF2）发病机制中的需求，NF2是一种由NF2基因位点突变引起的主要遗传性癌症疾病。NF2基因的蛋白产物Merlin已被证明通过PAK负调节信号传导，Merlin的抑癌功能至少部分通过抑制PAK介导。通过基于RNAi的方法敲低PAK1和PAK2的表达，损害培养中NF2-null神经鞘瘤细胞的增殖，并抑制其在体内形成肿瘤的能力。这些数据表明PAK是潜在的治疗靶点。通过对小分子文库的高通量筛选，结合结构-活性关系方法，鉴定出FRAX597（一种小分子嘧啶酮）是I族PAK的有效抑制剂。FRAX597/PAK1复合物的结晶特征确定了一个苯环，该苯环穿过门卫残基，并将噻唑定位在ATP结合位点的后腔中，该位点很少被激酶抑制剂靶向。FRAX597在培养中抑制NF2缺陷型神经鞘瘤细胞的增殖，并在体内显示出强大的抗肿瘤活性，在NF2原位模型中损害神经鞘瘤的发育。这些研究确定了一类新的口服ATP竞争性I组PAK抑制剂，具有治疗NF2和其他癌症的巨大潜力。

关键词：酶抑制剂；梅林；蛋白激酶；雪旺细胞；信号转导；小分子；nf2；p21激活激酶。

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数字

图1。
图1。
FRAX597的特性。 A类、化学结构和IC50FRAX019和FRAX414。B类FRAX597的化学结构。C类，FRAX597对I组PAKs1-3和II组PAK4的抑制情况。10个浓度点各重复一次。天，FRAX597抑制PAK1自身磷酸化（p-PAK1）的Western blot分析。SC4细胞在所示FRAX597浓度下培养2 h，然后提取蛋白质。肌动蛋白被用作加载控制。
图2。
图2。
PAK1/FRAX597复合物的结构。 A类PAK1的整体结构，FRAX597结合在活性部位。N端波瓣如所示浅灰色，铰链区域如所示深灰色，C端波瓣如所示鲑鱼C螺旋线已标记。B类，对应于FRAX597的电子密度。Fo−Fc电子密度图如所示绿色并在建立抑制剂模型之前计算出2σ的等高线。
图3。
图3。
FRAX597在PAK1活性位点内相互作用的详细视图。 A类，与FRAX597复合物中PAK1活性位点的视图。对形成抑制剂结合袋的残留物进行标记。显示了FRAX597中重要碳原子的编号。B类、门卫残留物和ATP结合部位后腔的表面视图。与抑制剂结合有关的残留物已贴上标签。C类、抑制剂的范德瓦尔斯球面表示法和形成ATP结合位点后腔的残留物的表面表示法。天，FRAX597对野生型PAK1和Val342突变体的抑制情况。10个浓度点中的每一个在1μ米ATP和20 n米PAK1。
图4。
图4。
FRAX597对I组PAK的效力和选择性的结构基础。 A类PAK1的共晶结构与FL172（PDB ID 3FXZ）、Ru-邻苯二甲酰亚胺（PDB ID4DAW）和FRAX597重叠。为了清晰起见，仅显示PAK1/FRAX597结构的蛋白质链。B类PAK4/CGP74514A（PDB ID 2CDZ）和PAK1/FRAX597的重叠共晶体结构说明了两种激酶之间后囊大小的差异。PAK4如所示蓝色，PAK1如所示灰色。C类，RET（PDB ID 2IVU）和PAK1激酶的重叠共晶体结构表明FRAX597的噻唑配体不是由RET的后囊最适容纳的（如“绿色”).天RET和PAK1的表面视图和卡通表示，展示了后袋的大小和C螺旋的位置的差异。RET表面和C螺旋线概述于绿色和PAK1 C螺旋灰色.
图5。
图5。
FRAX597抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长体内. A类将SC4 Nf2-完整细胞镀在三个孔中，并用FRAX597（1μ米)或DMSO对照组每天治疗4天，每天对细胞数进行评分。所示实验是三个独立实验的代表。B类，SC4细胞在细胞周期不同阶段的处理百分比。通过PI染色和FACS分析测定处理后SC4细胞的DNA含量。所示实验是三个独立实验的代表。C类，在治疗第14天用FRAX597（100 mg/kg）或载体对照药物治疗的原位肿瘤小鼠的生物发光成像（BLI）代表性图像。NOD/SCID小鼠神经内注射5×104SC4/pLuc-mCherry细胞，10天后进入治疗。小鼠每天治疗14天，每3天成像一次，以跟踪肿瘤的发展。天，对治疗队列的通量读数进行定量分析。混合效应模型分析表明，治疗组肿瘤生长速度明显低于对照组(第页=0.0002）。E类，在用FRAX597或载体对照治疗的队列中肿瘤/体重比的分布。的结果t吨等方差检验显示FRAX-A组的平均肿瘤重量比明显低于对照组(第页= 0.0001). 对于体内实验n个=6，每个队列重复三次实验。
图6。
图6。
I组PAK的抑制介导FRAX597对SC4细胞的抑制。 A类Western blot分析SC4细胞与相关阳性对照细胞Yes1、TEK、CSF1R和Ret的表达。Tubulin被用作负荷控制。B类将SC4 Nf2-完整细胞镀在三个孔中，并用PF3758309（1μ米)或DMSO对照组每天治疗4天，每天对细胞数进行评分。所示实验是三个独立实验的代表。
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