Dynein interacts with the neural cell adhesion molecule (NCAM180) to tether dynamic microtubules and maintain synaptic density in cortical neurons

doi:10.1074/jbc.M113.465088

.2013年9月27日；288(39):27812-24.

doi:10.1074/jbc。M113.465088。 Epub 2013年8月19日。

Dynein与神经细胞粘附分子（NCAM180）相互作用，以栓系动态微管并维持皮层神经元的突触密度

埃兰·珀尔森¹, 亚当·亨德里克斯, 雅各布·E·拉撒路, 科伦·本·雅科夫, 塔尔·格拉德斯, 马里科·托基托, Erika L F Holzbaur公司

附属公司

PMID： 23960070
预防性维修识别码： PMC3784697美元
内政部： 10.1074/jbc。M113.465088号

Dynein与神经细胞粘附分子（NCAM180）相互作用，以栓系动态微管并维持皮层神经元的突触密度

埃兰·珀尔森等。生物化学杂志. 2013.

.2013年9月27日；288(39):27812-24.

doi:10.1074/jbc。M113.465088。 Epub 2013年8月19日。

作者

埃兰·珀尔森¹, 亚当·G·亨德里克斯, 雅各布·E·拉撒路, 科伦·本·雅科夫, 塔尔·格拉德斯, 马里科·托基托, Erika L F Holzbaur公司

附属

¹来自萨克勒医学院生理学和药理学系。

PMID： 23960070
预防性维修识别码：项目经理3784697
内政部： 10.1074/jbc。13465088南非兰特

摘要

细胞质动力蛋白具有细胞器马达的良好特性，但在体外，动力蛋白还起到栓系和稳定动态微管plus-ends的作用。在这里，我们确定了动力蛋白与神经细胞粘附分子（NCAM）的180-kDa亚型之间的一种新的直接相互作用。光学捕获实验表明，通过NCAM180相互作用域结合到珠子上的动力蛋白可以系住投射的微管plus-ends。活细胞分析表明，NCAM180依赖性地向皮层募集动力蛋白，导致细胞外围投射到NCAM180斑块的微管选择性稳定。在异源细胞分析中，dynein-NCAM180相互作用也增强了细胞间粘附。Dynein和NCAM180从小鼠脑提取物和突触体部分共沉淀，与神经元的内源性相互作用一致。因此，我们检测了初级皮层神经元的微管动力学和突触密度。我们发现，NCAM的耗竭、强啡肽-NCAM180相互作用的抑制或低剂量诺卡唑对微管动力学的抑制都会导致突触密度显著降低。基于这些观察结果，我们提出了一个关于动力蛋白在突触中作用的工作模型，在该模型中，通过与粘附分子的结合将马达锚定到皮层，从而介导动态微管脉冲ends的栓系，从而加强突触的稳定。

关键词：细胞骨架；动态失稳；戴恩；微管；NCAM；突触；突触体。

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数字

**图1。**
**动力蛋白和NCAM180之间的直接相互作用将动力蛋白招募到细胞皮层。** A类，NCAM的三种主要亚型在哺乳动物神经元中表达：NCAM180、NCAM140和NCAM120。显示了在酵母双杂交筛选中鉴定的DBS，跨越NCAM180的975–1105残基。*TM（TM）*，跨膜结构域。B类，重组DIC与NCAM180的DBS结构域直接结合。使用GST或GST-DBS进行拉下试验，并在纯化的重组DIC浓度增加的情况下进行培养(*rDIC公司*)如前所述。GST-DBS与重组DIC结合*K（K）_d日*0.18±0.02μ米.C类，动力蛋白和动力蛋白通过重组GST-DBS而不是通过GST从小鼠脑裂解物中沉淀。输入占总数的10%；用DHC、DIC和dynactin（p150）抗体检测蛋白质印迹^胶水亚单位）。D类，dynein与NCAM180特异性相互作用。NCAM180，而不是NCAM140或NCAM120，是从小鼠脑提取物中沉淀出来的，重组DIC结合到珠子上。Dynactin（p50亚单位）作为阳性对照，BSA对照珠作为阴性对照。输入，占总数的10%。E类，DIC下拉(*PD公司*)来自用小鼠同种型NCAM180、NCAM140、NCAM120或用缺乏动力蛋白结合位点NCAM180ΔDBS的构建体转染的COS7细胞的实验证明了动力蛋白-NCAM180相互作用的特异性及其对DBS结构域的依赖性。输入（总数的10%），DIC下拉(*驾驶员信息中心PD*)、和BSA控制下拉列表(*控制PD*)用NCAM抗体检测样本；动力蛋白(*第50页*)作为阳性对照。F类DBS结构的共同表达破坏了内源性动力蛋白与来自COS7细胞的NCAM180的共同免疫沉淀；单独使用蛋白a珠的对照免疫沉淀(*IP（IP）*:*Ctrl键*)图中还显示了。*G公司*，dynein-NCAM180相互作用的破坏是剂量依赖性的。免疫共沉淀(*IP（IP）*)将纯化的重组GST-DBS（0、1、3和10μg DBS添加到1 mg裂解液中的总蛋白中）可抑制脑裂解液中含有NCAM的内源性动力蛋白。输入，占总数的10%。*误差线*、瑞典。

**图2。**
**NCAM180和动力蛋白栓系微管plus-ends在体外和细胞内。** A类，在达因存在（+）或不存在（−）的情况下，将GST DBS结合的珠或GST结合的对照珠与纯化的微管一起孵育；用免疫印迹法评价与强啡肽抗体的结合(*驾驶员信息中心*)和微管蛋白(*机器翻译*).输入，占总数的10%。动力蛋白和微管都与GST-DBS珠结合，但不与对照珠结合。B类使用光阱将DBS-dynein结合珠定位在微管扩散脉冲端附近，微管在其负端与盖玻片结合。与珠子接触后，微管plus-end的横向扩散显著减少，如最大投影和显示微管末端动力学随时间变化的kymograph所示。C类，COS7细胞中外源性NCAM180的表达将动力蛋白招募到细胞皮层（NCAM180）。DBS结构的共表达消除了动力蛋白向皮层的募集。插图显示了*在下面*在*放大倍数增加。比例尺*，25微米。D类，稳定表达DHC-GFP的HeLa细胞中NCAM180的表达诱导动力蛋白向皮层NCAM180斑块的募集(箭头); 在未转染的对照细胞中未观察到这种皮层定位。*比例尺*，10微米。E类，微管投射到细胞皮层，并在表达NCAM180的COS7细胞中位于细胞表面的NCAM斑块处短暂稳定(红色RFP-NCAM180；绿色，GFP-EMTB，一种用于报告微管动力学的微管相关蛋白）。F类，表达NCAM180的COS7细胞微管动力学的活细胞成像（参见补充视频1–3). 首字母缩写*双色图像*(红色RFP-NCAM180；绿色，GFP-EMTB）显示了微管plus-end在NCAM180补丁上的栓系(左边). 时间序列显示了微管plus-end随时间的系留(白点)在皮质NCAM180贴片上(概述在里面红色)在COS7细胞中。注意未捆绑微管的强大动力学(*彩色圆点*和线)同一单元格内；线指示微管随时间的变化轨迹，以及点指示初始位置。*G公司*，微管尖端轨迹远离(左边)和NCAM补丁(*正确的*)显示了系留微管的阻尼动力学特性。轨迹对齐，使微管尖端的初始位置位于原点。*H（H）*，在NCAM补片处抑制微管尖端动力学。跟踪微管远离的尖端位置(蓝色和*绿色轨道*,顶部)和在NCAM补丁中(红色,*黄色的*、和*橙色轨迹*,底部)显示了微管生长和束缚微管缩短的动力学改变。点，微管尖端位于NCAM补丁中的时间点。我，微管尖端速度直方图(红色)并且远离(蓝色)NCAM180位于皮层。这个插入显示微管plus-ends速度绝对值的平均值、25和75%四分位(第页<0.05；方差分析）。

**图3。**
**细胞-细胞的相互作用依赖于微管动力学和动力蛋白-NCAM的相互作用。** A类和B类COS7细胞分别转染GFP、NCAM180或NCAMΔDBS，或转染NCAM180和动力蛋白抑制剂CC1。NCAM180诱导的聚集增强(第页<0.05），当DBS被删除或强啡肽被显性阴性结构CC1的共同表达所抑制时，未观察到（44）。C类，COS7细胞转染NCAM180，然后用低剂量（100 n米)或高剂量（10μ米)诺卡唑作用40分钟。诺卡唑通过高剂量诺卡唑解聚细胞微管或降低低剂量诺卡唑微管动力学来阻断NCAM180表达诱导的增强聚集。相对于表达GFP的对照细胞，对聚集物中的细胞百分比进行评分。*误差线*，S.E.来自≥3个重复。

**图4。**
**Dynein和NCAM都定位于突触部位，并从突触体部分共沉淀。** A类，动力蛋白(绿色,左边)和NCAM(绿色,*正确的*)用突触蛋白定位(红色)与神经丝-H染色相比，皮质神经元中。*比例尺*，50微米。B类，动力蛋白(红色,左边)和NCAM(红色,中心)两者都定位于突触位点以及突触前标记突触绿色，在14DIV皮层神经元的过程中。突触后标记物PSD-95的共定位(红色,面板在*正确的*)带有突触素(绿色)显示以进行比较。*比例尺*，10微米。使用Imaris软件从阈值化的突触前和突触后图像中确定共定位百分比（41）；显示了代表性信号(*结肠镜检*)每对*在下面*免疫染色图像。C类、NCAM和动力蛋白与突触体共同纯化。所有三种主要的NCAM亚型（NCAM180、-140和-120）都存在于孤立的突触体中，同时还存在动力蛋白(*驾驶员信息中心*)和dynactin(*第50页*). 上清液(*S公司*)和颗粒(*P（P）*)脑匀浆组分和突触体富集组分(同步)在突触小体部分选择性富集的突触后标记PSD-95和耗尽的细胞溶质标记GAPDH中进行了探测。D类和E类小鼠脑突触体的下拉实验表明，NCAM180是由重组DIC结合珠沉淀的(D类)内源性动力蛋白与NCAM抗体共同免疫沉淀(E类).

**图5。**
**抑制dynein-NCAM180相互作用会破坏微管动力学，并降低初级皮层神经元的突触密度。** A类，突触微管动力学。用EB3-mCherry和GFP-突触素转染皮层神经元，以成像微管动力学和突触位点。显示在*左侧面板*是来自单个时间点的代表性图像，显示在*正确的*是由时间序列中沿神经元过程绘制的线生成的波形图。A类*白色箭头*在显微照片和日程表中均表示同一个具有代表性的EB3彗星。这些数据表明，EB3彗星优先终止于对照神经元的突触位点。B类DBS的表达改变了突触微管动力学。在表达NCAM180 DBS的神经元中，EB3彗星不再优先终止于突触部位。代表性显微照片显示在左边，时间序列中的日程表显示在*正确的*，具有相同的彗星尾*两个面板*由*白色箭头*NCAM-DBS结构域的表达减少了EB3彗星终止于突触的比例(n个>超过7个神经元中有85颗彗星）。C类根据突触前和突触后标记物（突触蛋白(顶部)和PSD-95(底部)).D类通过测量KCl刺激的FM4-64摄取，NCAM180中DBS的表达降低了皮层神经元的突触密度。E类皮层神经元中NCAM-DBS的表达干扰了FM4-64阳性突触位点的出现。转染NCAM180中DBS的皮层神经元突触的面积强度降低(*星展银行*; 86±19个任意单位(*美国。*))与控制神经元相比(*Ctrl键*; 164±31个任意单位，第页< 0.05). DBS转染神经元的突触也更宽，2.4±0.6μm，而对照神经元的突起为1.8±0.4μm(*半高宽比*；第页< 0.05).F类和*G公司*，使用突触前和突触后标记物的共定位评估DBS表达诱导的突触密度的定量降低(第页< 0.01,n个=三个实验中15个神经元的突触>1000个；*误差线*，S.E.）(F类)或FM4-64摄取(第页< 0.01,n个=6个实验中18个神经元的突触>1000个）(*G公司*).H（H），抑制微管动力学会降低突触密度。DBS表达对突触密度的影响可以与低剂量诺可唑（50 n米持续20小时）(第页< 0.01,n个=27个神经元，两次实验中突触>500个）。实验值是相对于同一天的对照测量的，因为突触密度取决于镀层密度和DIV。我，使用四种不同的shRNA耗尽NCAM(*shRNA 1-4*)与对照组相比，显性阴性DBS结构的构建或表达导致了突触密度的类似降低(*无低压*无慢病毒感染；*GFP公司*表达GFP的慢病毒感染；*DBS控制*，模拟转染）。对于所有人面板，*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.J型Western blot检测靶向NCAM的shRNA结构慢病毒表达对皮层神经元培养物中NCAM亚型的缺失；ERK免疫反应作为负荷对照。

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