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.2013年8月12日；8（8）：e71449。
doi:10.1371/journal.pone.0071449。 2013年电子收集。

EphA2诱导的尤文肉瘤细胞血管生成通过bFGF的产生而起作用，并依赖小窝蛋白-1

米盖尔·萨因兹·贾斯佩多 1, 胡安·韦尔塔斯·马丁内斯, 劳拉·拉加雷斯·泰纳, 胡安·马丁自由党, 西尔维娅·马特奥·洛扎诺, 恩里克·德·阿拉瓦, 卡门·德·托雷斯, 杰姆·莫拉, 泽维尔·加西亚·德尔·穆罗, 奥斯卡·M·蒂拉多
附属公司

EphA2诱导的尤文肉瘤细胞血管生成通过bFGF的产生而起作用，并依赖小窝蛋白-1

米盖尔·萨因兹·贾斯佩多等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

血管生成是肿瘤微环境和信号分子共同作用的结果。血管生成开关表现为促血管生成因子和抗血管生成因子之间的不平衡，是肿瘤发展过程中的一个速率控制步骤。Eph受体酪氨酸激酶及其膜锚定配体（称为ephrins）构成最大的受体酪氨酸蛋白激酶（RTK）亚家族，被认为是促血管生成RTK的主要家族。尤因肉瘤（EWS）是一种侵袭性很强的骨和软组织肿瘤，影响儿童和年轻人。与其他实体肿瘤一样，EWS依赖于功能性血管网络来提供营养和氧气，并清除废物。基于EphA2在促进血管生成中的生物学作用，我们探讨了该受体的功能性作用及其与小窝蛋白-1（CAV1）在EWS血管生成过程中的关系。我们证明，在3种不同的体内模型上，缺乏CAV1会导致微血管密度（MVD）显著降低。在体外，这种现象与EphA2受体失活、缺乏AKT反应和bFGF下调有关。我们还证明了EWS细胞分泌的bFGF作为内皮细胞的化学引诱剂。此外，EphA2和CAV1之间的相互作用对于受体通过AKT产生bFGF并促进内皮细胞迁移的正确定位和信号传递是必要的。最后，将EphA2的显性负性形式引入EWS细胞，主要再现了CAV1沉默所产生的效应，强烈表明轴EphA2-CAV1参与促进内皮细胞向有利于EWS血管生成的肿瘤迁移。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。CAV1沉默可减少EWS中的血管生成。
答：。免疫印迹显示，与未转染细胞和转染空载体的细胞相比，稳定表达CAV1 shRNA的RDES、TC71和SKES1细胞的选定克隆中的CAV1水平显著降低。β-肌动蛋白作为负荷对照。B。小鼠异种移植体积比较来自分组对照细胞的肿瘤（亲本n===========================================================5; 空向量n===========================================================5） 和2个CAV1敲低细胞（n===========================================================每克隆5个）；巴，SD（*P≤0.05）C、。相应石蜡包埋肿瘤的苏木精和伊红染色。星号表示坏死湖泊比例尺，50µm。D。CD31免疫组化检测石蜡包埋肿瘤中阳性血管。箭头表示血管染色标尺，50µm。图表显示了所有三种模型的MVD比较，并显示了CAV1敲除细胞中血管的持续减少；巴，SD（*P≤0.05）。
图2
图2。CAV1沉默导致内皮细胞迁移减少。
答：。比较CAV1敲除模型的条件培养基（CM）与无血清的RPMI作为阴性对照（n===========================================================3).B。定量内皮细胞迁移，其中来自RDES和TC71模型的CM用作内皮细胞的化学引诱剂；巴，SD（*P≤0.05 n===========================================================3)C、。磷酸-FAK免疫荧光。用来自TC71 CAV1敲除模型的CM培养的内皮细胞，显示磷酸化-FAK芽减少。比例尺，20µm。D。在TC71模型的CM中生长的PAEC细胞中分析FAK的表达。在用TC71对照CM生长的细胞中，Blot显示35 kd裂解FAK形式的表达高于用TC71 Sh-CM生长的细胞。
图3
图3。CAV1沉默导致bFGF转录和分泌减少。
答：。在CAV1敲除的模型中分析bFGF的表达，显示bFGF的表达在所有模型中都不断受到影响。该图显示了根据RT-PCR图像的条带强度确定的OD体积的定量，显示了CAV1敲除的细胞中bFGF的统计学显著减少；巴，SD（*P≤0.05 n===========================================================3)B。免疫印迹显示TC71模型的总蛋白提取物或CM中bFGF减少。肌动蛋白印迹和胭脂红染色用作负荷对照。测量波段相对强度的定量数据显示在每条车道下方（n===========================================================3)C、。内皮细胞迁移的量化。CM被用作内皮细胞的化学引诱剂。中和抗体-N.Ab-（2.5μg/ml和5μg/ml）和重组蛋白-R.Prot-（10 ng/ml）；bar，SD（*P<0.002–与父母CM相比–和*P===========================================================0.0005–与克隆n相比===========================================================3） 分别用于阻止和促进迁移。单独使用RPMI培养基作为阴性对照。
图4
图4。EphA2受体在EWS细胞中表达并组成性激活。
答：。EWS细胞系中EphA2的免疫印迹B。CAV1敲除模型中EphA2的免疫印迹显示，与亲代细胞和对照细胞相比，敲除细胞中的EphA2表达略有降低。C、。用磷酸酪氨酸印迹的EphA2免疫沉淀和用EphA2印迹的磷酸酪氨酸免疫沉淀证实了其组成性激活。D。RDES模型的免疫荧光显示，由于CAV1沉默，EphA2在细胞质中重新分布。DAPI用于鉴定细胞核。比例尺，10µm。
图5
图5。CAV1与EphA2受体相互作用。
答：。CAV1和EphA2的共免疫沉淀显示了它们的相互作用。B。CAV1和EphA2的共同免疫荧光显示在RDES细胞的细胞膜中共同定位。DAPI用于鉴定细胞核。用皮尔逊相关系数（PCC）PCC测量共定位等级===========================================================0.65±0.009. 比例尺，10µm。
图6
图6。刺激EphA2通过激活AKT促进bFGF转录。
答：。免疫印迹显示，与CAV1击倒饥饿细胞相比，对照细胞对肾上腺素-A1刺激的反应中EphA2磷酸化程度更高。使用EphA2印迹作为对照。B。免疫印迹显示对照细胞中AKT的激活，RT-PCR显示ephrin-A1刺激后bFGF转录较高。ERK1/2磷酸化没有显示出显著的变化。测量谱带相对强度的定量数据显示在每条车道下方，用于磷-AKTs西部分析（n===========================================================5)C、。免疫印迹显示在存在AKT抑制剂（5µM）的情况下，ephrin-A1刺激的TC71细胞中AKT激活被阻断。测量波段相对强度的定量数据显示在每条车道下方（n===========================================================5).D和E。通过RT-PCR显示bFGF转录物的变化。测量波段相对强度的定量数据显示在每条车道下方（n===========================================================3).
图7
图7。显性阴性EphA2概括了CAV1对血管生成的沉默作用。
答：。磷酸酪氨酸免疫印迹证实EphA2-Kd载体在RDES和TC71细胞中的显性负作用（空载体转染细胞的RD/CMV和TC/CMV状态）。以EphA2印迹法为对照。B。EphA2-Kd转染后，EphA2的免疫荧光显示其在细胞质中重新分布。比例尺，10µm。C、。EphA2-Kd模型中的CM被用作内皮细胞的化学引诱剂，以量化跨阱细胞迁移；巴，SD（*P≤0.05 n===========================================================3); 垂直条表示相对于对照组迁移内皮细胞的平均百分比。D。小鼠异种移植瘤体积比较2个EphA2-Kd细胞克隆（n===========================================================每个克隆5个）相对于分组对照（亲本n===========================================================5; 空向量n===========================================================5); 垂直条表示与对照组相比肿瘤体积的平均百分比；巴，SD（*P≤0.05）E.公司。MVD比较了两种EphA2-Kd模型，并显示与对照组相比，选定克隆的血管减少；巴，SD（*P≤0.05）F、。ephrin-A1刺激的TC71模型（对照和EphA2-Kd克隆）的免疫印迹显示ERK1/2通路和AKT激活没有变化。测量谱带相对强度的定量数据显示在每条车道下方，用于磷-AKTs西部分析（n===========================================================5)G.公司。RT-PCR显示，与EphA2刺激后的EphA2-Kd细胞相比，对照细胞中bFGF的表达增加。测量波段相对强度的定量数据显示在每条车道下方（n===========================================================3).
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    1. Sainz-Jaspeado M、Lagares-Tena L、Lasheras J、Navid F、Rodriguez-Galindo C等（2010）Caveolin-1调节尤因肉瘤的转移能力。Mol Cancer Res 8:1489–1500。-项目管理咨询公司-公共医学
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