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.2013年8月8日;8(8):e71318。
doi:10.1371/journal.pone.0071318。 2013年电子收集。

Osterix-cre标记的祖细胞有助于骨髓基质的形成和维持

附属公司

Osterix-cre标记的祖细胞有助于骨髓基质的形成和维持

刘亚玲等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

我们使用Osterix-EGFPCre和Osterix-CreERt动物模型进行了命运定位研究,发现Cre报告基因在构成骨髓基质的许多不同细胞类型中表达。组分命运映射导致了位于整个骨髓中的不同细胞成分的标记,而E14.5的时间命运映射导致骨髓区域内细胞的标记。构成和时间命运图标记的细胞类型的一致性包括成骨细胞、脂肪细胞、血管平滑肌、神经周细胞和基质细胞。对E14.5dpc标记的胚胎前体细胞进行长时间追踪显示,其子代在10个月龄之前仍然存在,这表明标记的命运标记胚胎前体可以产生长寿命的骨髓祖细胞。为了进一步证明骨髓祖细胞的标记,来自Osterix-EGFPCre/Ai9小鼠的骨髓培养物显示,基质细胞保留了Cre报告基因的表达,并产生了一个FACS分类的群体,该群体能够在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,并分化为成骨肉细胞和脂肪细胞,以及移植后的血管周围基质细胞。总之,我们的研究揭示了Osterix-Cre标记的胚胎祖细胞产生成人骨髓祖细胞的发育过程,这些骨髓祖细胞建立并维持骨髓基质。

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数字

图1
图1。可视化OEC公司骨髓内介导的Cre Reporter表达。
(A–C)除了激活成骨细胞系细胞中Cre报告基因的表达(以白色显示)外,OEC公司小鼠骨髓腔内非造血细胞广泛标记。(A’–C’)苏木精复染组织切片对应图像A–C。放大倍数越来越高(B类C类,黄色虚线框区域),在骨髓基质细胞中观察到Cre报告基因表达。(C、 C’)在高倍镜下,许多Cre报告基因表达细胞保留着长而窄的突起,使人想起骨髓网状细胞和血管窦。(D) 在6周龄股骨的骨小梁成骨细胞或骨髓中未检测到Osterix EGFPCre报告基因的表达。然而,通过免疫染色检测骨小梁成骨细胞和骨细胞(E)中Osterix的表达。
图2
图2。世俗的成骨相关转录因子抗体胚胎前体的命运图揭示了它们在骨髓中的持久性。
(A类)成骨相关转录因子抗体-CreERt小鼠与Ai9公司小鼠进行时间命运图绘制。在胚胎发育的第14.5天,给孕妇注射一次三苯氧胺注射液。F1后代在E15.5和1、4、8、32和43周龄时收获。(B类)8周龄股骨的组织切片显示有利于骨近端的Cre报告基因表达(以白色显示)。(B’)相应的苏木精复染股骨,如B所示(C–F类)沿着股骨近端远轴拍摄的骨髓和相邻皮质骨的高倍图像(用红色虚线描记)。在近端(C类)Cre报告表达细胞在骨髓和皮质骨中丰富。沿股骨远端移动(D类)在皮质骨(红色虚线)和相邻骨髓(黄色虚线)中观察到Cre报告基因表达细胞的明显缺口,而骨髓中心仍保留着大量Cre报告蛋白表达细胞。(E、 F类)沿着股骨的远端位置检测到的Cre报告表达细胞(如果有的话)要少得多。
图3
图3。成骨相关转录因子抗体-Cre命运图标记骨髓血管周围基质细胞。
内皮细胞标记物CD31的免疫染色显示OEC公司(A–C1)和ORt公司(D–F型)命运定位并没有导致Cre报告基因在内皮细胞中表达,而是在与骨髓血管窦相关的血管周围基质细胞群中表达。(A、 A1、,D类)Cre报告者表情(以红色显示)。(B、 B1、,E类)CD31免疫染色(以绿色显示)。(C、 C1、,F类)重叠显示Cre报告基因表达细胞与骨髓血管系统的关联。
图4
图4。成骨相关转录因子抗体-Cre-Fate映射标记骨髓血管平滑肌。
Cre报告者表达被激活OEC公司(A–C1G–L)和ORt公司(D–F型M–O型)小鼠在血管平滑肌细胞中表达,该细胞包含纵向穿过骨髓中心的小动脉。通过CD31的组合鉴定血管平滑肌(A–F)和平滑肌肌动蛋白α2(SMA)(G–O公司)免疫染色。血管平滑肌的标记仅限于骨髓室,因为位于皮质骨表面外的血管平滑肌细胞不包含任何Cre报告基因表达(J–L型). (A、 A1、D、G、J、M)Ai9公司Cre报告人的表情显示为红色(B、 B1、E)CD31免疫染色显示为绿色。(H、 K、N)SMA免疫染色显示为绿色。(C、 C1、F、I、L、O)合并的图像。
图5
图5。成骨相关转录因子抗体-Cre-Fate映射标记骨髓脂肪细胞。
OEC公司(A–F)和ORt公司(G–I型)激活Ai9公司Cre报告基因在骨髓脂肪细胞中表达,在组织切片中呈空的圆形细胞。表达骨髓脂肪细胞的Cre报告子(A、 C、E、G、H)使用aP2-EGFP青色报告鼠(B类,白色箭头标记的蓝色荧光脂肪细胞),Perilipin免疫染色(D类白色箭头标记绿色荧光脂肪细胞),苏木精复染组织切片显示圆形空洞(我,黑色箭头)。脂肪细胞的标记仅限于骨髓室,因为位于骨皮质外的脂肪组织没有Cre报告基因表达(E、 F类).
图6
图6。成骨相关转录因子抗体-Cre命运图标记骨髓神经周细胞。
OEC公司(A-i2号机组)和ORt公司(J–L型)激活Ai9公司Cre报告基因在神经周细胞中表达(红色),神经纤维(绿色)周围形成管状物,位于骨髓室(A–F和J–L)、皮质骨通道(g2、h2、i2)和邻近外骨膜(g1、h1、i1)。通过神经丝M(B、E、H、h1、h2、K、绿色)的免疫染色鉴定神经纤维。
图7
图7。组织的成骨相关转录因子抗体-Cre命运图标记骨髓基质细胞群。
(A类)交叉成骨相关转录因子抗体-Cre小鼠Ai9公司Cre报告小鼠产生含有以下成分的双转基因后代成骨相关转录因子抗体-Cre和Ai9公司Cre记者(红老鼠)。(B类)骨髓冲洗液中存在Cre报告表达细胞,其中一个子集在最初24小时内开始粘附到组织培养板上。(C类)第5天基质培养OC9+细胞(成骨相关转录因子抗体-Cre-mediated Cre reporter expressing population)代表粘附细胞部分的一个亚群,并保留间充质细胞形态。(D、 E类)第5天基质培养的FACS分析表明,OC9+细胞占总细胞数的15-20%。(F–H(飞行高度))第5天骨髓基质培养中Osterix的免疫染色导致核局部染色(绿色),仅限于约68%的OC9+细胞(红色)。(I–K型)培养5天后,用FACS收集OC9阳性和阴性细胞组分。定量RT-PCR显示OC9+细胞中已知血管周围基质基因标记Angpt1、Cxcl12和SCF适度上调。
图8
图8。OC9+细胞的体外分化显示了其多功能特性。
OC9+细胞是从第5天基质培养物中分离出来的FACS细胞,在培养物中重新种植,并分化为成骨细胞(A–F,S),脂肪细胞(G–L、T),和软骨细胞(M–R、U). (A、 D、G、J、M、P)检测Ai9公司Cre记者的表情。(B、 E、H、K、N、Q)DIC光学下的文化成像。(C、 F、I、L、O、R)培养物的整块染色成像。(S–U型)通过定量RT-PCR对分化进行时间评估。(A–C)在成骨条件下分化的OC9+细胞产生了坚固的矿化基质,可以在DIC光学下观察到(B类)和von Kossa染色(C类). (D–F型)在无成骨条件下生长的OC9+细胞没有生成矿化基质,也没有被von Kossa染色。(S公司)在培养第0、3、6和9天检测成骨细胞分化。所有成骨基因标记物在分化过程中均显著上调,包括骨钙素(Bglap1基因),骨唾液蛋白(IBSP公司),牙本质基质蛋白1(DMP1公司)、和成骨相关转录因子抗体. (G–I型)OC9+细胞在成脂条件下分化产生的细胞含有大的脂泡,在DIC光学下很容易观察到(H(H))并被油红O染色(). (J–L型)在非成脂条件下生长的对照培养物没有显示大的脂质泡(K(K))或油红-O染色(L(左)). (T型)在培养的第0、3、6和9天检测脂肪分化。所有脂肪生成基因标记在分化过程中均显著上调,包括脂联素,脂滴包被蛋白,脂肪酸结合蛋白4(制造厂4)、和降脂素. (M–O型)在成软骨条件下分化的OC9+细胞产生了在DIC光学下明显的浓缩软骨细胞区域(N个)Alcian蓝染色呈强阳性(O(运行)). (P–R(P–R))在非成软骨条件下生长的对照培养物没有产生浓缩软骨细胞的区域()没有染上阿尔西安蓝(R(右)). (U) 在培养的第0天、第7天和第14天检测软骨分化。所有软骨生成基因标志物在分化过程中都显著上调,包括Sox9指数,阿格雷坎,2型胶原αI(第2a1列)、和胶原蛋白10型α1(第10a1列).
图9
图9。OC9+细胞移植显示其多功能特性。
基质细胞来源于Osterix-Cre公司/Ai9公司将小鼠培养5天,装入支架,然后移植到股骨骨缺损处。(A类)在6周内用x射线监测骨缺损的愈合情况。(B、 D类)移植后6周在股骨组织切片中检测OC9+细胞子代(红色)。(C、 E类)与中所示的组织切片相同A类D类现在用苏木精复染。(B类)低倍图像显示OC9细胞子代(红色)参与DIC成像和苏木精复染(紫色)检测到的皮质骨和小梁骨组织。黄色箭头表示宿主骨骼和供体骨骼之间的边界。(D、 E类)高倍镜显示,除了分化成成骨细胞和制造骨组织外,OC9+细胞还有助于骨髓内的骨髓脂肪细胞和血管窦内的血管周细胞(B = 骨骼,F = 脂肪细胞和S = 血管窦)。

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