Direct isolation of myofibroblasts and fibroblasts from bleomycin-injured lungs reveals their functional similarities and differences

doi:10.1186/1755-1536-6-15

.2013年8月8日；6(1):15.

doi:10.186/17555-1536-6-15。

从博莱霉素损伤的肺中直接分离肌成纤维细胞和成纤维细胞揭示了它们的功能相似性和差异性

赤松大辅¹, 尤西福米·阿莱, 伊索·科苏吉, 川崎秀也, Shiori Meguro公司, 坂尾真纪子, 柴田清彦（Kiyoshi Shibata）, Takafumi Suda公司, Kingo Chida公司, 岩田俊熙

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PMCID公司：项目经理3751789
内政部： 10.1186/175-1536-6-15

从博莱霉素损伤的肺中直接分离肌成纤维细胞和成纤维细胞揭示了它们的功能相似性和差异性

赤松大辅等。纤维生成组织修复. 2013.

.2013年8月8日；6(1):15.

doi:10.1186/1755-1536-6-15。

作者

赤松大辅¹, 尤西福米·阿莱, 伊索·科苏吉, 川崎秀也, Shiori Meguro公司, 佐冈牧子, 柴田清彦（Kiyoshi Shibata）, Takafumi Suda公司, Kingo Chida公司, 岩田俊熙

附属

¹滨松大学医学院再生与感染病理学系，日本滨松市东町邯郸1-20-1。toshiiwa@hama-med.ac.jp。

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内政部： 10.1186/1755-1536-6-15

摘要

背景：肌成纤维细胞在组织修复中起着至关重要的作用。肌成纤维细胞和成纤维细胞之间的功能相似性和差异尚不完全清楚，因为它们尚未从活体中分离出来。本研究的目的是建立一种用荧光激活细胞分选法直接分离损伤肺中肌成纤维细胞和成纤维细胞的方法，并比较它们的功能。

结果：我们证明，谱系特异性细胞表面标记物（lin），如CD31、CD45、CD146、EpCAM（CD326）、TER119和Lyve-1在肌成纤维细胞或成纤维细胞中不表达。博莱霉素损伤的肺和盐处理的肺的成纤维细胞显示富含linneg Sca-1high，博莱霉素受损的肺的肌成纤维细胞则显示富含linne Sca-1low CD49ehigh。体外增殖试验的结果表明，博来霉素损伤的肺的成纤维细胞的体外增殖，而不是肌成纤维细胞和盐水处理的肺的成纤维细胞的体外增殖。然而，成纤维细胞和肌成纤维细胞在体内可能具有较低的增殖能力。qRT-PCR对胶原和胶原合成酶基因的分析表明，大约一半的基因在博莱霉素损伤肺的成纤维细胞和肌成纤维细胞中的表达水平显著高于盐处理肺的成细胞。相比之下，肌成纤维细胞11个趋化因子基因中有8个的表达水平显著低于成纤维细胞。

结论：这是首次研究表明直接从受损肺部分离肌成纤维细胞和成纤维细胞的方法。我们证明了肌成纤维细胞和成纤维细胞在增殖能力和胶原蛋白、胶原蛋白合成酶和趋化因子基因表达水平方面的功能相似性和差异性。因此，这种直接分离方法具有从肌成纤维细胞和成纤维细胞获得有用信息的巨大潜力。

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数字

图1
**博莱霉素损伤肺模型的特征。（A）**小鼠（实线，N个=10）气管内注射博莱霉素。在用博莱霉素治疗的小鼠中，到第12天死亡率高达70%。**（B）**第12天的盐处理肺(N个=3）和博莱霉素在第12天损伤肺部(N个=3）同时均质。在第12天，博莱霉素损伤的肺中的羟脯氨酸含量高于盐水处理的肺。结果表示三个实验的平均值（±s.d.）。**（C）**盐处理肺的BAL液(N个=3）在第12天采集。在第3天收集博莱霉素治疗肺的BAL液(N个= 3), 6 (N个=3）和12(N个= 5). 在第3天、第6天和第12天，BAL液中IL-6和TGF-β1的浓度显著高于经盐处理的肺。结果表示三个或五个实验的平均值（±s.d.）。**（D）**博莱霉素或生理盐水处理的小鼠BAL液中的细胞总数和差异数（虚线）。在第12天收集经盐处理的肺的BAL液(N个= 3). 在第3天收集博来霉素处理的肺的BAL液(N个= 3), 6 (N个=3）和12(N个= 5). 虚线表示经盐处理的肺的BAL液平均值。结果表示三个或五个实验的平均值（±s.d.）。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.001; ***,*P（P）*< 0.0001. 支气管肺泡灌洗；标准偏差。

图2
**在博莱霉素损伤的肺中，肌成纤维细胞表达1型胶原。**盐水处理的肺用福尔马林固定并用H&E染色检查**（A）**并使用抗α-SMA抗体**（B）**和抗Col1A1抗体**（C）**给予博莱霉素后12天，用H&E染色检查福尔马林固定的博莱霉素损伤的肺**（D）**并使用抗α-SMA抗体**（E）**和抗Col1A1抗体**（F）**在第12天，将快速冷冻的博来霉素损伤的肺固定在冷丙酮中，并使用抗α-SMA抗体通过免疫荧光进行检查**（G）**和抗Col1A1抗体**（H）**使用DAPI将后两个图像与核染色合并**（一）**星号和箭头分别表示肺和支气管上皮。在**（G）**,**（H）**、和**（一）**，箭头表示α-SMA-和Col1A1双阳性细胞。星号表示间隙中的Col1A1。图中显示了具有代表性的结果。比例尺英寸**（A）**到F）显示200μm。（G至I）中的比例尺表示100μm。α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；Col1A1，胶原蛋白1A1，DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

图3
**肌成纤维细胞或血管周细胞中不表达谱系特异性细胞表面标记物。（A）**在第12天将速冻博莱霉素损伤的肺固定在丙酮中，并使用针对谱系特异性细胞表面标记物（CD31、CD45、EpCAM、TER119、CD146和Lyve-1）的FITC-结合抗体（左）和抗α-SMA抗体（中）进行免疫荧光检测；这两幅图像与DAPI（右侧蓝色）合并。图中显示了具有代表性的结果。比例尺指示100μm。**（B）**将速冻盐处理的肺固定在丙酮中，并用DAPI（左）和FITC-结合血统特异性细胞表面标记物抗体（CD31、CD45、EpCAM、TER119、CD146和Lyve-1）进行免疫荧光检测（中）；这两幅图像被合并（右）。箭头表示定位于肺动脉外膜的细胞，并且对谱系特异性细胞表面标记物呈阴性。星号表示肺动脉。图中显示了具有代表性的结果。比例尺指示50μm。**（C）**单个肺细胞，如附加文件所示1：图S3绘制了APC结合抗CD31、CD45、EpCAM和TER119抗体与FITC-结合抗CD146和Lyve-1抗体的对比。未分离的细胞从图中的方框中进行分类。林^否定细胞从APC和FITC双阴性组分中分离出来，如长方形所示。不分青红皂白、平淡无奇；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

图4
**肌成纤维细胞和成纤维细胞富含lin**^否定**盐处理的肺细胞和博莱霉素损伤的肺细胞。（A）**的表达式级别*学报2*和*第1a1列*比较了盐处理后肺组织中未分化细胞的mRNA表达^否定第12天，盐处理肺细胞、博莱霉素损伤肺的未分化细胞和lin^否定用qRT-PCR检测第12天博莱霉素损伤的肺细胞。将结果标准化为生理盐水处理的肺的未分级细胞的表达水平。使用三个独立制备的RNA样品进行三次QRT-PCR。结果表示三个实验的平均值（±s.d.）。*，*P（P）*< 0.01.（B）比较两组细胞内α-SMA的表达水平^否定第12天（左）博莱霉素损伤的肺细胞和lin^否定使用FITC-偶联的抗α-SMA抗体处理肺盐细胞（右）。如图所示2C，10000排序lin^否定将细胞固定在10%福尔马林中，然后渗透并与小鼠FITC-结合的同种控制抗体（IgG）孵育_2a个)或FITC-结合抗α-SMA抗体。FITC-α-SMA（黑线）或FITC-共轭同型对照（灰线）的荧光强度^否定显示单元格。图中显示了具有代表性的结果。不分青红皂白、平淡无奇；标准偏差。

图5
**探索肌成纤维细胞和成纤维细胞的细胞表面标记物。（A）**在第12天将速冻博来霉素损伤的肺固定在丙酮中，并使用抗α-SMA抗体（左上）、抗CD49e抗体（右上）和APC结合抗Sca-1抗体（左下）进行免疫荧光检测；三个图像被合并（右下角）。箭头表示肌成纤维细胞。图中显示了具有代表性的结果。比例尺指示100μm。**（B）**第12天将速冻博来霉素损伤的肺固定在丙酮中，并用DAPI（左上）、针对谱系特异性细胞表面标记物（CD31、CD45、EpCAM、TER119、CD146和Lyve-1）的FITC-结合抗体（右上）和PE-结合抗Sca-1抗体（左下）进行免疫荧光检测；这三幅图像被合并（右下）。箭头表示位于肺动脉外膜的细胞，其血统特异性细胞表面标记物阴性（右上），而Sca-1阳性（左下）。图中显示了具有代表性的结果。比例尺指示50μm。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

图6
**富含肌纤维母细胞和富含纤维母细胞人群的鉴定。（A）**流式细胞仪图显示CD49e的表达(x个-轴）和Sca-1(年-lin的轴）^否定第12天（右），盐处理的肺细胞（左）和博莱霉素损伤的肺细胞。林^否定Sca-1型^高的盐水处理的肺（群体A）和博来霉素损伤的肺在第12天（群体B）用圆圈表示。林^否定Sca-1型^低的CD49e^高的博莱霉素损伤的肺在第12天（人群C）和林^否定Sca-1型^低的CD49e^低的第12天博莱霉素损伤的肺（人群D）显示为长方形。图中显示了具有代表性的结果。**（B）**使用FITC-偶联抗α-SMA抗体显示A、B、C和D人群细胞内α-SMA表达水平的直方图。作为对照，使用FITC-结合的同种对照抗体。图中显示了具有代表性的结果。**（C）**来自A、B、C和D群体的分选细胞生长36 h，固定在4%多聚甲醛中，并使用抗α-SMA抗体（绿色）、抗波形蛋白抗体（红色）和DAPI（蓝色）进行免疫细胞化学。活细胞的相控图像显示在下部面板中。图中显示了具有代表性的结果。比例尺指示100μm。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

图7
***In-vitro公司***和体内**肌成纤维细胞和成纤维细胞的增殖能力。（A）**来自群体A、B和C的200个分选的细胞在12孔板中生长。该图表示每个群体的粘附细胞数，在排序后的第1天、第4天、第7天和第10天进行计数。实验一式三份进行。结果表示三个实验的平均值（±s.d.）。*，*P（P）*< 0.01.（B）左图显示了A群Hoechst 33342染色细胞DNA直方图的细胞周期分布。左侧的高峰代表G群中的细胞₀G公司₁相位，右侧的低峰值代表G中的细胞₂M相。两个峰值之间的区域代表S相的细胞。G中细胞的比例₂M期在盐处理肺的谱系特异性细胞表面标记阳性细胞（盐处理肺谱系阳性细胞）和A、B和C群（右）之间进行比较。条形图表示G中细胞的比例₂M相。实验一式三份进行。结果表示三个实验的平均值（±s.d.）。星号表示*P（P）*< 0.001. 标准偏差。

图8
**直接分离细胞的胶原蛋白、胶原蛋白合成酶和趋化因子基因的表达谱。**对三种直接分离的细胞进行聚类和树状图分析，即盐处理肺的成纤维细胞（SF1、SF2和SF3）、第12天博莱霉素损伤肺的成细胞（BF1、BF2和BF3）以及第12天博莱霉素损伤肺部的肌成纤维细胞。使用三个独立制备的RNA样品进行三次QRT-PCR。原始原始数据显示在附加文件中1：表S4和S5。

图9
**直接分离的肌成纤维细胞和培养的成纤维细胞的表达谱。**对三种直接分离的细胞（SF1、SF2、SF3、BF1、BF2、BF3、M1、M2和M3）和在TGF-β1存在下培养的肌成纤维细胞（TGF+1、TGF+2、TGF+3）进行聚类和树状图分析。使用三个独立制备的RNA样品进行三次QRT-PCR。原始原始数据显示在附加文件中1：表S4和S5。

**图10**
**肌成纤维细胞发育模型。**当组织受到损伤时，常驻成纤维细胞被激活，然后开始产生更多胶原蛋白和趋化因子。活化的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞后，它们仍会产生胶原蛋白，但不会像成纤维细胞和活化的成细胞那样产生趋化因子。其他类型的细胞，如间皮细胞、内皮细胞、上皮细胞和循环纤维细胞也参与肌成纤维细胞的发育。

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