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.2013年8月12日；26(3):315-23.
doi:10.1016/j.devcel.2013.06.016。 Epub 2013年8月1日。

REEP3/4确保内质网与中期染色质的清除以及适当的核膜结构

安娜·洛尔·施莱茨 1, 汤普森, 凯瑟琳·C·L·王, 约翰·耶茨（John R Yates）第三, 丽贝卡·希尔德
附属公司

REEP3/4确保内质网与中期染色质的清除以及适当的核膜结构

安娜·洛尔·施莱茨等。 开发人员单元格. .

摘要

膜结合细胞器和微管细胞骨架之间的动态相互作用对于在整个细胞周期中建立、维持和重塑细胞的内部组织至关重要。然而，对这些相互作用的分子性质仍知之甚少。我们对微管膜连接子进行了生化筛选，并鉴定了REEP4，一种以前未经特征化的内质网（ER）蛋白。来自HeLa细胞的REEP4和密切相关的REEP3的耗竭导致细胞分裂缺陷和来自核膜的核内膜的增殖。这种表型起源于有丝分裂，即ER膜在中期染色体上积累。染色体的微管结合和有丝分裂内质网清除都依赖于连接REEP4两个疏水结构域的带正电的短氨基酸序列。我们的结果表明，REEP3/4的功能是多余的，可以清除中期染色质中的内质网，从而确保通过有丝分裂和适当的核膜结构进行正确的进展。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。REEP3和REEP4的耗尽导致相间核包络缺陷
（A） 用HeLa细胞中稳定表达ER标记物GFP-Sec61β的特异性抗体对内源性REEP4进行染色。REEP4核膜和ER染色在对照细胞中明显，但在REEP4缺失的细胞中不明显。两者都存在抗体的核内背景染色。（B） 表达GFP-Sec61β的HeLa细胞经Lamin B1染色。在对照细胞中，GFP-Sec61β和Lamin B1标记仅限于核边缘，而在REEP3/4双敲除细胞中，细胞核内可见大量GFP-Sec六十一β和LaminB1阳性结构。（C） HeLa细胞联合转染靶向REEP3/4的siRNA和编码抗mcherry或RNAi版本的HA标记REEP3或REEP4的质粒，并对HA和Lamin B1进行染色。表达REEP3或REEP4的细胞恢复正常的核形态。比例尺为10µm。参见图S1和电影S1。
图2
图2。有丝分裂时出现核膜缺陷
（A） 表达GFP-Sec61β和组蛋白H2B-mcherry的HeLa细胞在中期存活。GFP-Sec61β主要被排除在对照细胞的染色体区域之外，但在REEP3/4 RNAi细胞中与染色质广泛相关。（B） 有丝分裂中表达GFP-Sec61β的HeLa细胞的延时采集静态图像。在对照细胞中，GFP-Sec61β被排除在染色质之外，直到核膜重组开始。在REEP3/4 RNAi细胞中，GFP-Sec61β在整个后期和核膜重组期间与染色体相关。随后，在核膜改造后，它逐渐地、不完全地从核内部清除，一些残余物仍然存在（箭头所示）。对于REEP3/4 RNAi，显示了一个较晚的最终时间点（39分钟而不是对照的20分钟），以说明ER从核内部的清除和核内膜的持久性。请参阅电影S2。（C） 通过延时采集表达GFP-Sec61β和H2B-mcherry的对照和REEP3/4 RNAi-HeLa细胞的静态图像。初始帧显示为GFP-Sec61β和H2B-mcherry信号。下面，时间序列仅显示GFP-Sec61β信号，以使内质网蓄积可辨别。在对照细胞中，染色质区域在中期过程中仍然没有ER，但在REEP3/4 RNAi细胞中，ER积聚在中期板上。（D） REEP3/4 RNAi细胞中期板内质网蓄积的定量，与后期发病前12分钟的初始帧相比，变化%。测量中期平板上GFP-Sec61β荧光的平均像素强度。数据为所分析的10个细胞的平均值±SEM。每个时间点的平均值在t=−12 min到p<0.05（t=–8 min和t=–4 min）和t=0 min到p<0.005之间存在显著差异。p值是使用双尾、非配对学生的t吨-测试。比例尺代表10µm。见图S2。
图3
图3。REEP3/4的缺失会损害子核的分离，并导致染色体分离缺陷的增加
（A） 顶部面板：控制和REEP3/4在细胞分裂后期耗尽的细胞。与对照组相比，REEP3/4 RNAi子细胞核之间的分离减少。底部面板：REEP3/4 RNAi细胞染色体分离缺陷示例。比例尺为10µm。（B） 子核分离的量化。当卵裂沟缩小到≤1µm时，对照细胞中的细胞核分离了12.5µm，而REEP3/4 RNAi细胞中只有8.9µm。数据是来自三个独立实验的平均+/-SEM。在每个实验中，至少分析了14个对照细胞和22个REEP3/4 RNAi细胞。在使用双尾、非配对Welch’st吨-测试。（C） 染色体分离缺陷的量化（后期桥和滞后染色体）。11.1%的对照细胞和16.6%的REEP3/4 RNAi细胞出现染色体分离缺陷。所示数据为七个实验的平均+/-SEM。每个条件和实验至少分析50个细胞。使用双尾非配对学生的控制和REEP3/4 RNAi与p<0.03显著不同t吨-测试。。
图4
图4。微管结合对REEP3/4功能很重要
（A） REEP蛋白家族的示意图。阴影区域代表疏水区域。显示了连接疏水结构域的细胞质延伸序列。（B） 用HA标记的REEP4和REEP4/5嵌合蛋白（REEP4dMT）对微管共粒试验样品进行蛋白质印迹。85%的野生型REEP4-HA，但只有13%的REEP4dMT-HA与微管共沉淀。（C） 中期对表达GFP-Sec61β和组蛋白H2B-mcherry的HeLa细胞进行实时成像。RNAi抗性野生型REEP4的表达可恢复REEP3/4 RNAi细胞染色体的ER清除，而RNAi耐药性REEP4dMT的表达则无法挽救。比例尺为10µm。（D） 如图（C）所示，从图像中量化总和中期平板GFP-Sec61β荧光。显示了细胞GFP-Sec61β荧光在中期板上的分数。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM。每个实验和条件至少分析10个细胞。对照组和REEP3/4 RNAi的平均值（p<0.002）以及对照组和RESP3/4 RNAi+REEP4dMT-HA（p<0.02）有显著差异。对照组与REEP3/4 RNAi+REEP4-HA WT的平均值无显著差异（p>0.4）。REEP3/4 RNAi与REEP3/4RNAi+REEP4dMT-HA的平均值没有显著差异（p>0.7）。p值是使用一个双尾、未配对的学生的t吨-测试。（E） 描述REEP3/4功能的模型。在野生型细胞中，REEP3/4将内质网转运到微管负端，从而清除染色体，阻止内质网向染色质移动，并在纺锤体两极聚集内质网。在没有REEP3/4的情况下，内质网从染色体上的清除失败，内质网对染色体区域的入侵导致中期板的积累。WT：野生型。见图S3。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 有丝分裂前准备。
    伯克B。 伯克B。 开发单元。2013年8月12日；26(3):221-2. doi:10.1016/j.devcel.2013.07.018。 开发单元。2013 PMID：23948250

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