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.2013年10月；38(8):3146-58.
doi:10.1111/ejn.12331。 Epub 2013年8月5日。

GABA（A）受体可以启动功能抑制性GABA能突触的形成

塞琳·富克斯 1, 卡琳·阿比特波尔, 杰迈玛J负荷, 奥黛丽·默瑟, 劳拉布朗, 乔纳森·伊鲍尔, F安妮·斯蒂芬森, 亚历克斯·M·汤姆森, 贾斯米娜·约万诺维奇
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GABA（A）受体可以启动功能抑制性GABA能突触的形成

塞琳·富克斯等。 欧洲神经学杂志. 2013年10月.
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摘要

选择抑制性GABA能轴突突触后靶点和形成第一次接触的机制目前尚不清楚。为了确定GABAA受体（GABAA-Rs）本身的表达（GABAA能突触的基本功能性突触后成分）是否足以启动突触接触的形成，设计了一种新的共培养系统。在该系统中，突触前GABA能轴突起源于胚胎大鼠基底神经节中棘神经元，而其最常见的突触后靶点，即α1/β2/γ2-GABAA Rs，在稳定转染的人胚肾293（HEK293）细胞系中组成性表达。通过突触前和突触后标记物在2小时内的共定位检测到这些共培养物中的第一个突触样接触。接触数量在24小时达到一个平台。通过活细胞成像评估，这些接触是稳定的；通过摄取荧光标记的突触球蛋白囊泡蛋白域特异性抗体来确定它们的活性；他们支持自发和动作电位驱动的突触后GABA能电流。超微结构分析证实了活跃突触的典型特征。对照组或N-甲基-d-天冬氨酸受体表达的HEK293细胞未观察到突触形成。当神经原-2与GABAA-Rs共同表达时，突触形成和强度显著增加，表明这些蛋白之间存在合作关系。因此，除了发挥重要的功能作用外，突触后GABAA-Rs还可以促进抑制性轴突的粘附和功能性突触的发育。

关键词：抑制；神经原-2；突触后；突触前；突触粘附；突触发生。

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数字

图1
图1
HEK293-GABA公司A类表达功能性α1β2γ2-GABA的R细胞A类Rs由共同培养的胚胎GABA能介质棘神经元支配。（A） 用识别GABA胞外结构域的抗体进行细胞表面标记A类稳定转染的HEK293-GABA中的Rα1、β2/3和γ2亚基A类R细胞系。比例尺：20μm。（B） HEK293细胞对GABA（1μ米)，吹气作用（10秒）在很近的地方，有很大的向内电流。唑吡坦（0.4μ米)共同应用于沐浴介质(n个 = 3). （C） GABA能神经元GAD65阳性端与突触后α1和γ2 GABA形成的突触样接触的免疫标记A类HEK293-GABA中表达的R亚基A类R电池。比例尺：10μm。（D） HEK293-GABA中sIPCS的记录A类控制介质中的R电池（上记录道），以及TTX应用（1μ米)mIPSC，在无荷包牡丹碱（10μ米). （E） 接触形成的时间过程。每个HEK293-GABA的假定触点数量A类第2、4、8、24和48小时的R细胞，以及第4和24小时的每个对照HEK293细胞（平均值±SEM，n个=每种情况下8，来自两个独立实验）。（F） HEK293-GABA比例A类显示IPSC的R细胞在共培养至24小时时随时间增加（来自两个独立实验的2、4、8、24和48小时的平均值±SEM）。
图2
图2
在“错配”共培养实验中，GABA的表达A类HEK293细胞中的R或NMDA受体未能分别促进与谷氨酸能神经元或GABA能神经元的接触。（A和B）与（A）HEK293-NMDAR–YFP表达细胞或（B）仅表达YFP的HEK293细胞共同培养的GABA能神经元GAD65阳性末端的免疫标记。比例尺：10μm。（C和D）与（C）HEK293-GABA共培养的海马谷氨酸能神经元的囊泡谷氨酸转运体1（VGLUT1）阳性末端的免疫标记A类表达pCherry和GABA的R细胞A类Rs（γ2亚单位）或（D）HEK293细胞仅表达pCherry。比例尺：10μm。（E） 海马谷氨酸能神经元与HEK293-GABA共培养24小时后形成的假定接触的量化A类R细胞或HEK293细胞（平均值±SEM，n个=16，来自两个独立实验），或GABA能神经元与HEK293-NMDAR–YFP细胞或HEK293-YFP细胞之间（平均值±SEM，n个=16，来自两个独立的实验），与GABA能神经元和HEK293-GABA之间形成的接触数量相比A类R细胞或HEK293细胞均表达pCherry（平均值±SEM，n个=8，根据每个条件下的两个独立实验）。
图3
图3
GABA公司A类Rs促进活跃突触接触的形成。（A和B）突触前神经末梢（抗GAD65）形成的接触物的免疫标记，包括囊泡蛋白结构域特异性抗突触素抗体（Cy5）和（A）HEK293-GABA的表面A类R细胞或（B）仅表达pCherry的HEK293细胞（比例尺：10μm）。（C） 与HEK293细胞表面接触的活性末端的定量表示为突触前标记物和pCherry（任意单位；平均值±SEM；HEK293-GABAA类R中，n个=16，来自两个独立实验；HEK293，n个=20，来自四个独立实验**P（P）<0.05，学生t检验）。（D） 神经元与HEK293-GABA接触的超微结构A类用抗突触素抗体（Cy3）（比例尺：10μm）（来自两个独立实验的D1a和D2a）标记并鉴定R细胞（见插入物）。所选触点（i和ii）的截面如D1b、c和D2b–f所示。在每种情况下，D1b和D1c以及D2b和D2c显示了在没有倾斜（倾斜）和有倾斜（比例尺：1μm）的情况下拍摄的相同截面。D2c中的倾斜显示了精细HEK293-GABA上的第二个标记触点A类R电池过程。单个触点的连续截面如D2d–f所示，D2g表示该触点的三维重建。D2b–f中的白色箭头表示用HRP–二氨基联苯胺标记的突触前小泡。（E） 与用抗突触素抗体（a，Cy3）标记的对照HEK293细胞潜在接触的超微结构（比例尺：10μm）。Eb–g显示Ea中标有*的选定触点的连续截面（比例尺：1μm）。Eh表示此接触的三维重建。与对照HEK293细胞的接触没有显示出突触接触的典型结构特征。
图4
图4
GABA公司A类Rs支持功能性突触的形成。三个HEK293-GABA中的（A–D、E–G和H–K）IPSCA类R细胞。（A、E和H）叠加在单扫描sIPCS上的平均sIPSC和mIPSC（A）以及AP-IPSC（E和H。（B、F和I）平均IPSC和SDTC缩放和叠加显示，平均值中包含的单扫描IPSC具有相似的形状，并且（对于E和H）具有相似的起始潜伏期。（C） 平均sIPSC和mIPSC以及（J）平均刺激诱发的AP-IPSC和sIPSC，通过缩放和叠加来比较时间进程，证明每个HEK293-GABA中的所有sIPCS、mIPSC和AP-IPSCsA类R细胞形态相似。（D、G和K）mIPSC和sIPSC的IPSC振幅分布（D），双重记录期间记录的AP-IPSC（G），以及sIPSC和AP-IPSCs（刺激诱发）（K）。同一HEK293-GABA中的sIPSC和mIPSC振幅A类在D中比较R细胞，在K中比较相同细胞中的sIPSC和AP-IPSC。插入物比较七个（D）和四个（K）HEK293-GABA的平均IPSC振幅A类R电池。
图5
图5
GABA公司A类用NL2表达的Rs促进进一步的突触发生。（A和B）突触前神经末梢（抗GAD65）之间接触的免疫标记，包括管腔域特异性抗突触素抗体（Cy5）和HEK293-GABA表面A类R-NL2细胞（A）或HEK293-NL2细胞的细胞（B）（NL2–pCherry）（比例尺：10μm）。（C） HEK293-GABA表面活性终端的量化A类R-NL2或HEK293-NL2细胞，表示为突触前标记物和突触后NL2–pCherry（任意单位；平均值±SEM；HEK293-GABAA类R-NL2，n个=14来自两个独立实验；HEK293-NL2，n个=22来自四个独立实验**P（P）<0.05，学生t检验）。
图6
图6
GABA的共同表达A类Rs和NL2增强突触效能。三个HEK293-GABA中的IPSCA类R-NL2细胞（A-D、E-H和I-L）。（A、E和I）。平均sIPCS和mIPSC（A）、平均AP-IPSCs（双记录vs.细胞外刺激）和sIPCs（E和I）叠加在单扫描sIPCS上。（B、F和J）经缩放和叠加的平均IPSC和SDTC表明平均值中包含的事件形状相似。（C） 平均sIPSC和mIPSC，（G）平均sIPCS和AP-IPSC（双重记录），（K）平均AP-IPSS（刺激诱发）和sIPSC，缩放和叠加以比较时间进程。（D、H和L）。IPSC振幅分布用于比较同一细胞中sIPCS和mIPSC（D）以及AP-IPSCs和sIPSC（H和L）的振幅。插入内容比较七（D）、五（H）和五（L）个单元格的平均IPSC振幅。
图7
图7
IPSC的时间进程：HEK293-GABA中mIPSC、sIPCs、双记录AP-IPSCs和刺激诱发AP-IPSC（平均值±SEM）的特性A类R电池（左）和HEK293-GABAA类R-NL2细胞（右）。（A） RT的比较。（B） HW的比较。星号表示两个种群之间的显著差异(*P（P） < 0.05, ***P（P）<0.001，单向方差分析). 条形图中的数字表示每个群体中包含的细胞数量。没有显示不带NL2的AP-IPSC（双记录）的时间进程参数，因为这些AP-IPSCs的两个示例之一是在室温下记录的，因此不具有可比性。
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