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.2013 11月1日;442(1):97—103。
DOI:101016/J.AB.2013.07.022。 EPUB 2013 7月26日。

利用毛细管-西方系统精确定量测定内源性蛋白质

附属
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利用毛细管-西方系统精确定量测定内源性蛋白质

陈金秋等。 肛门生物化学. .
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摘要

在复杂的生物环境中精确和准确地定量蛋白质表达水平是具有挑战性的。在这里,我们描述了使用自动毛细管免疫分析系统,基于大小的简单的西方系统(最近开发的蛋白质简单)绝对定量的细胞裂解物中的内源性蛋白质的方法。该方法能够精确地测量每微克细胞裂解物在皮克或亚皮克水平的靶蛋白的绝对量。测量不依赖于细胞基质或细胞裂解缓冲液,且不受不同抗体亲和力对其特异性表位的影响。然后,我们应用此方法定量蛋白激酶C(PKC)亚型在LNCaP和U937细胞中的绝对表达水平,这两种细胞系广泛用于探测PKC靶向配体的下游生物反应。我们的绝对定量证实了PKCδ在两种细胞中的优势,支持PKC异构体在这些细胞系中的重要功能作用。此处描述的方法提供了一种精确地定量蛋白质表达水平并将蛋白水平与功能相关的方法。除了相对于传统的西方分析增强的准确性之外,它规避了与来自不同亲和力的不同抗体的信号强度相比固有的失真。

关键词毛细管免疫分析;蛋白激酶C(PKC);定量蛋白质分析;简单西医。

数据

图1
图1。LNCaP裂解液中内源性Erk2的定量测定
将GST-Erk2重组蛋白的连续稀释加入到16.5 ng LNCAP裂解液中,将重组蛋白/细胞裂解物样品与样品加载主混合物混合,并用简单的Western系统进行分析,如方法所描述的。(a)伪凝胶和(b)使用抗Erk1/2抗体印迹的简单西医结果的电泳图像;(c)GST-Erk2信号强度与GST-Erk2的量的加标作图。检测线性度为1.25至40 PG GST-Erk2;(d)内源性Erk2测定的线性回归分析。当强度比为1时,从最佳拟合线性曲线预测GST-Erk2的6.67 pG。数据是有代表性的实验。虚线表示95%个秘密间隔。
图2
图2。基质效应对Erk2信号的影响
将10 GPG(运行1和3)或20 GPG(运行2)的GST-Erk2加入到Hela、MCF-7和LNCaP细胞裂解物中,用M- PER或RIPA缓冲液制备,并用简单的Western系统进行分析。(a)一个代表性运行的伪凝胶图像表示在用M PER或RIPA缓冲液制备的不同细胞裂解物中几乎相同的GST-Erk2信号强度。(b)将GST-Erk2信号归一化为Hela M裂解液中的GST-Erk2信号并进行比较。
图3
图3。LNCaP和U937细胞PKC亚型的比较
(a)qPCR定量PKC亚型。对LNCaP和U937细胞制备的RNA进行实时RT-PCR分析,使用预先设计和验证的引物作为指示基因和GAPDH作为对照。数据来自三个独立实验的平均±SEM值。(b)常规Western印迹分析。从LNCaP和U937细胞制备的15克总细胞裂解物在SDS-PAGE上分离,电转移和免疫印迹与所指示的抗体。使用三个独立实验的所有PKC信号使用相同的ECL曝光时间的代表性图像被示出。肌动蛋白信号作为负荷控制。(c)使用图1中描述的方法对PKC亚型蛋白进行绝对定量。数据表示来自至少三个独立实验的平均±SD值(详见补充表)。

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