Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation

doi:10.1101/gr.154872.113

.2013年10月；23(10):1563-79.

doi:10.1101/gr.154872.113。 Epub 2013年7月26日。

染色质上的Sumoylation调控对细胞生长和增殖至关重要的转录程序的协同抑制

海尔·内尔·卡恩¹, 穆萨·本哈迈德, 桃叶, 圣埃芬妮·勒格拉斯（Stéphanie Le Gras）, 杰克·克里斯托普·科斯克, 皮埃尔·拉帕奎特, 奥利弗·比肖夫, Maia Ouspenskaia公司, 玛丽·达索, 雅各布·西勒, 欧文•戴维森, 安妮·德让

附属公司

PMID： 23893515
预防性维修识别码：项目经理3787255
内政部： 10.1101/克.154872.113

染色质上的Sumoylation调控对细胞生长和增殖至关重要的转录程序的协同抑制

海尔·内尔·卡恩等。基因组研究. 2013年10月.

.2013年10月；23(10):1563-79.

doi:10.1101/gr.154872.113。 Epub 2013年7月26日。

作者

海尔·内尔·卡恩¹, 穆萨·本哈迈德, 陶冶, 狂欢节, 杰克·克里斯托普·科斯克, 皮埃尔·拉帕奎特, 奥利弗·比肖夫, Maia Ouspenskaia公司, 玛丽·达索, 雅各布·西勒, 欧文·戴维森, 安妮·德让

附属

¹法国巴黎F-75015细胞生物学和感染系核组织和肿瘤发生实验室巴斯德研究所；

PMID： 23893515
预防性维修识别码：项目经理3787255
内政部： 10.1101/克.154872.113

摘要

尽管对特定的sumoylated转录调控因子进行了大量研究，但SUMO在染色质上与转录调控相关的全局作用仍基本未知。在这里，我们确定了SUMO1和SUMO2/3以及UBC9（由UBE2I编码）和PIASY（由PIAS4编码）的全基因组定位，这两个标记是活性sumoylation，以及Pol II和组蛋白标记在增殖与衰老人类成纤维细胞中的定位，以及基因表达谱。我们发现，尽管SUMO单独在基因组中广泛分布，在活性启动子处有很强的关联，但活性SUMO酰化最显著地发生在组蛋白和蛋白质生物发生基因的启动子处，以及Pol I rRNA和Pol III tRNA。值得注意的是，这四类基因通过抑制sumoylation上调，表明SUMO通常会抑制其表达。与这一发现相一致的是，sumoylation-deficient细胞的细胞大小和整体蛋白水平都有所增加。引人注目的是，我们发现在衰老细胞中，SUMO机制选择性地保留在组蛋白和tRNA基因簇中，而它则从所有其他独特的染色质区域大量释放。这些数据揭示了SUMO景观的高度动态性，表明组蛋白和tRNA位点保持抑制环境是衰老状态的标志。因此，我们研究中采用的方法允许识别一种常见的生物输出，并揭示了迄今为止未知的染色质活性sumoylation功能，这是通过简单修饰物动态标记染色质的关键机制，协调细胞生长和增殖所必需的基因网络的协同转录调控。

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数字

**图1。**
SUMO1和SUMO2的染色质图谱。(A类)SUMO1协会(左边)和SUMO2(*正确的*)WI38细胞中含有Pol II、H3K4me3、H3K27me3和H3K9me3。SUMO占用位点周围±5 kb区域的标签密度比较。聚类确定了五个类别，如图所示。(B)五个不同基因组区域中SUMO位点分布的饼图表示。描述了每个区域的定义*在下面*. (C类)与TSS相关的SUMO1和SUMO2站点本地化频率。(D类)SUMO1峰周围SUMO2标签密度的比较(左边)SUMO2峰值周围的SUMO1标签密度(*正确的*). (E类)直方图表示H3K4me3、H3K27me3或H3K9me3峰与SUMO1和/或SUMO2峰重叠的百分比。

**图2。**
SUMO在活性转录基因的启动子处高度富集。(A类)TSS上SUMO1、SUMO2、Pol II和RNA-seq读数的聚类比较。(B)SUMO-bound TSS的表达状态（表达由三个mRNA-seq重复中至少两个RPKM定义）。(C类)SUMO1、SUMO2、Pol II和H3K4me3的合并剖面读取密度与活动TSS距离的关系。(D类)SUMO1、SUMO2和Pol II的平均分布读取显示低、中、高表达水平基因与TSS距离的密度。(E类)表示SUMO1-和SUMO2-标记的TSS之间重叠的维恩图。(F类)使用GREAT对SUMO1和SUMO2通常占用的TSS进行功能注释。图中显示了属于三个不同本体的顶级超表示类别。(*G公司*)常见SUMO1-和SUMO2-标记TSS的散点图比较。红色表示SUMO1/SUMO2读取比率≤0.5或≥2的TSS。(*H（H）*)富含SUMO1的TSS的IPA上游调节器分析（≥两倍）。(我)与中的相同*H（H）*但对于SUMO2。

**图3。**
SUMO富含组蛋白、核糖体蛋白和tRNA基因。(*A、 B类*)分配(A类)SUMO1-和(B)SUMO2通过峰高和TSS密度标记TSS，显示对应于最高SUMO峰的顶部四分位数，以灰色表示。使用DAVID对与前四分位TSS相关的基因进行功能注释。显示了代表人数最多的类别。表*在下面*总结了SUMO-bound TSS对组蛋白、tRNA和核糖体蛋白注释的统计富集。(C类)染色体6p中组蛋白和tRNA基因簇的ChIP-seq数据的基因组浏览器视图。(D类)tRNA位点SUMO1、SUMO2和H3K4me3标记密度的比较(*上面的*)它们的合并轮廓仅限于H3K4me3阳性子簇与TSS的距离(降低). (E类)SUMO1、SUMO2和H3K9me3在主要卫星重复序列（GSAT_MM）（tRNA）上的相对富集，*RN7SL1系列*(*7SL系列*),*RNU6号机组*(*6号机组*)与输入相比，ChIP-seq中的rRNA位点。(F类)用特异引物扩增rRNA基因的三个区域，对SUMO1和SUMO2进行ChIP-qPCR（Guetg等人，2012年）。*福斯公司*这里使用启动子作为阳性对照。

**图4。**
UBC9和PIASY的染色质图谱。(A类)UBC9协会(左边)和钢琴(*正确的*)WI38增殖细胞中含有SUMO1、SUMO2、Pol II、H3K4me3、H3K27me3和H3K9me3。UBC9或PIASY结合位点周围±5-kb区域的标记密度比较。聚类确定了四个类别，如图所示。(B)图1B所示五个不同基因组区域中UBC9和PIASY结合位点分布的饼图表示。(C类)维恩图表示SUMO1-和/或SUMO2-、UBC9-和PIASY-标记TSS之间的重叠。(D类)SUMO机器的合并剖面读取与TSS距离有关的密度。(*E、 F类*)基因组浏览器中显示的ChIP-seq数据视图*福斯公司*(E类)和*人力资源管理系统*位点(F类). (*G公司*)以SUMO、UBC9和PIASY标记的TSS的DAVID功能注释(左边)或SUMO、UBC9，但没有PIASY(*正确的*). 显示了代表人数最多的类别。

**图5。**
Sumoylation控制组蛋白和生长控制基因的表达。(A类)用表达对照shCt或shUBC9 shRNAs的慢病毒感染WI38细胞。选择后5天，用RT-qPCR分析指示基因的表达。(B)表达shCt或shUBC9的WI38细胞的Western blot分析显示组蛋白H3、H2A、H2B和H4的表达。Tubulin和Ponceau被用作负荷控制。UBC9的消耗以及伴随的全磺酰化和磺酰化合SP100的损失显示为击倒效率的控制。(C类)用对照siCt或siPIASY siRNA转染WI38细胞，并用RT-qPCR分析所示基因的表达。(D类)逆转录病毒感染的过表达PIASY或对照载体（WT）的WI38细胞中组蛋白mRNA差异表达的Affymetrix分析。(*E–G公司*)如中所示A类. (*H（H）*)前向散射分析（FSC）*Ubc9公司*^+/+（重量）和*Ubc9公司*^fl/-；T2段用三苯氧胺治疗（KO）MEF 7天（Demarque等人，2011年）（四个胚胎/基因型）；平均尺寸（FSC单位）：628±17.5(*Ubc9公司*^−/−)对594.3±7.1(*Ubc9公司*^+/+);*P（P）*-值=0.006；给出了一个典型示例。(我)通过标准化为细胞数的OD测量的总蛋白质水平*Ubc9公司*^+/+（重量）和*Ubc9公司*^fl/-；T2段用三苯氧胺处理（KO）MEF 7天（四个胚胎/基因型）；平均量（μg/mL）：219.3±32.9(*Ubc9公司*^−/−)对193.5±63.2(*Ubc9公司*^+/+);*P（P）*-值=0.019。(J型)如中所示A类.对于所有RT-qPCR，实验一式三份，数据表示为平均值±SEM(n个= 3).

**图6。**
UBC9的耗竭诱导基因表达程序的改变以及衰老相关的表型。(*A、 B类*)通过DAVID本体分析确定的热门类别上调(A类)并下调(B)shUBC9 WI38细胞中启动子中SUMO1和/或SUMO2标记的基因。(C类)表达shCt或shUBC9 shRNAs的慢病毒感染后WI38细胞的生长曲线。(D类)感染后4天（早期）和8天（晚期）EdU和SA-β-Gal阳性WI38细胞的百分比。(E类)显示SA-β-Gal染色的代表性显微照片。(F类)shCt或shUBC9 WI38提取物的Western blot分析显示衰老标记。肌动蛋白和GAPDH被用作负荷控制。(*G公司*)用表达shCt、shUBC9、GFP或HRAS的慢病毒感染的WI38细胞^G12伏用碘化丙啶染色，流式细胞仪进行细胞周期分析。(*H（H）*)显示HRAS Affymetrix基因表达谱重叠的维恩图^G12伏-诱导衰老和shUBC9 WI38细胞。热图*在下面*表示两个数据集中选定基因的折叠变化（FC）。(我)用对照shCt、shUBC9或HRAS对WI38感染细胞进行免疫染色^G12伏如图所示，PML（红色）、H3K9me3（绿色）和DAPI染色用于SAHF可视化。shUBC9细胞中独特的PML聚集物被用作敲除效率的阳性对照（Zhong等人，2000年）。(赖特)SAHF阳性细胞核相关百分比的图表。

**图7。**
SUMO机制是从衰老细胞的染色质中释放出来的。(A类)SUMO1与Pol II、H3K4me3、H3K27me3和H3K9me3在增殖（P）和HRAS中的相关性比较^G12伏-诱导衰老（S）WI38细胞。(B)增殖中SUMO1的ChIP-qPCR（P），HRAS^G12伏-诱导衰老（RAS）和复制衰老（RS）WI38细胞*MTBP/MRPL13平均无故障运行时间*和*福斯公司*发起人。(C类)对增殖细胞和衰老细胞进行分馏，并通过Western blot定量每个分馏中指示蛋白的存在。为总裂解物、Cyt（细胞质部分）、SNE（可溶核提取物）和颗粒（不可溶部分）加载等量的蛋白质。(D类)图中显示了6号染色体上增殖（红色）和衰老（蓝色）细胞的峰值密度。(E类)通过RNA-seq和SUMO1差异占有率测量的差异基因表达的散点图比较(左边)或SUMO2(*正确的*)增殖细胞与衰老细胞的（峰高倍数变化）。差分表达式显示为日志₂每RPKM的读取次数。

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