NC1 domain of collagen α3(IV) derived from the basement membrane regulates Sertoli cell blood-testis barrier dynamics

doi:10.4161/spmg.25465

.2013年4月1日；3（2）：e25465。

doi:10.4161/spmg.25465。

来自基底膜的胶原蛋白α3（IV）的NC1结构域调节支持细胞血-测试屏障动力学

Elissa W P Wong女士¹, C严成

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来自基底膜的胶原蛋白α3（IV）的NC1结构域调节支持细胞血-测试屏障动力学

Elissa W P Wong女士等。精子发生. 2013.

.2013年4月1日；3（2）：e25465。

doi:10.4161/spmg.25465。

作者

Elissa W P Wong女士¹, C严成

附属

¹玛丽·M·沃尔福德男性避孕研究实验室；生物医学研究中心；人口理事会；美国纽约州纽约市。

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摘要

血睾屏障（BTB）是精子发生的重要超微结构。新生大鼠BTB形成的延迟或其在成年大鼠中的不可逆损伤会导致减数分裂停滞和A型以外精原细胞分化的失败。而睾酮和FSH等激素对BTB功能至关重要，目前尚不清楚生精上皮中是否存在调节BTB功能的局部调节机制。在此，我们报道了大鼠睾丸基底膜的组成成分胶原蛋白α3（IV）链可以通过基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的有限蛋白水解生成非胶原蛋白（NC1）结构域肽[Colα3（Ⅳ）NC1]，并且MMP-9的表达受到TNFα的上调。而重组Colα3（IV）NC1蛋白在大肠杆菌可能由于缺乏糖基化，未能干扰Sertoli细胞紧密连接（TJ）-通透性屏障功能，发现哺乳动物细胞中产生的Colα3（IV）NC1重组蛋白，并通过亲和层析纯化到明显的同质性，可可逆地干扰Sertoni细胞的TJ屏障功能。有趣的是，Colα3（IV）NC1重组蛋白没有扰乱几种TJ-（例如，闭塞素、CAR、JAM-A、ZO-1）和基础胞质特化-（例如，N-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环素）的稳态水平BTB处的蛋白质，但在Sertoli细胞-细胞界面诱导蛋白质定位和/或分布的变化，这些蛋白质从细胞表面移动到细胞胞浆中，从而破坏TJ功能。这些发现说明存在一个称为BTB基底膜轴的局部调节轴，该轴在精子发生过程中调节BTB重组。

关键词：支持细胞；血睾屏障；胶原蛋白；胞质特化；非胶原结构域；睾丸；紧密连接。

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数字

**图1。**TNFα上调MMP-9，促进胶原（Col）IV的裂解，生成Colα3（IV）NC1结构域。(A类)使用固定在冰冷甲醇中的冷冻横截面研究Col IV在成年大鼠睾丸生精上皮中的定位，并用特异性抗Col IV抗体进行可视化（表1）。低倍（A:A）显微照片显示，Col IV在成年大鼠睾丸生精上皮细胞周期的所有阶段都有表达。（A:b）所示的高倍放大图像表明，Col IV局限于生精上皮的基底区域，与它在基底膜的定位一致。在成年大鼠睾丸间质的Leydig细胞（见A:b中的绿色箭头）以及内皮细胞和/或微血管基底膜（见A:b中的红色箭头）中也发现了免疫反应性Col IV。A:A和A:b中的比例尺分别为100µm和25µm。(B类)支持细胞培养在8×10⁴细胞/厘米²在没有Matrigel的6孔盘子上。在Sertoli细胞分离后2 d加入不同浓度的TNFα和TGF-α3。此后2天收获支持细胞条件培养基，并将每个样品的25µg蛋白质用于SDS-PAGE和免疫印迹。免疫印迹显示，TNFα（而非TGF-β3）可导致支持细胞分泌MMP-9的剂量依赖性增加（上图）。下面板是使用相应的支持细胞裂解物（25µg蛋白质）用抗β-肌动蛋白抗体进行的印迹免疫染色，以评估相等的蛋白质载量。(C类)使用重组MMP-9（0.5µg蛋白质）检测其是否诱导重组小鼠Col IV（BD Bioscience）（每条车道10µg蛋白）的裂解，以1:20（MMP9:Col IV）的比例（Mr 170–180 kDa的Colα3（IV）和Colα4（IV）），加或不加EDTA（MMP-9的抑制剂），生成Colα2（IV）NC结构域，通过免疫印迹法使用特异性抗Colα3（IV）NC结构域抗体（表1）检测到(C类)]. 中的下部面板(C类)是考马斯蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每条通道含10µg纯化重组Col IV蛋白，用于上图所示的实验，以证明本实验中使用了等量的Col IV。此处显示的数据是一项实验的代表性发现。然而，每个实验重复三次，不包括优化实验条件的先导性实验，使用n=3只大鼠的睾丸(A类)，从不同组的20日龄雄性幼崽中分离的支持细胞(B类)或不同批次的Col IV和MMP-9。在不同的实验中获得了类似的数据。

**图2。**重组Colα3（IV）NC1蛋白在细菌中的表达、纯化及其对Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能的影响。(A类)BL21（DE3）合格*大肠杆菌*用0.1 mM IPTG诱导pET46 Ek/LIC-Colα3（IV）NC1载体转化的细胞表达重组蛋白。当比较未诱导的总细胞蛋白（TCP）和诱导的TCP时，发现Colα3（IV）NC1结构域（28 kDa）的强表达，如典型的考马斯蓝染色凝胶（a:a）所示。Ni纯化重组蛋白²⁺-重组蛋白N末端的组氨酸（His，H）标记与Ni-column特异性结合的Sepharose色谱法。洗脱后的蛋白质被纯化到明显的同质性（A:b），并被抗-His（A:b:）和抗Colα3（IV）NC1抗体（A:c）识别（见表1）。(B类)原代Sertoli细胞在1.2×10⁶细胞/厘米²在时间0时，在Matrigel-coated双腔装置上，以允许组装功能性TJ-渗透屏障。如材料和方法中所述，将纯化的细菌Colα3（IV）NC1重组蛋白重新折叠并针对PBS进行透析，并在第2天将其以30μg/ml（~1µM）的浓度包含在F12/DMEM培养基中。与PBS对照组（Ctrl）相比，观察到Sertoli细胞BTB轻度但无统计学意义的扰动（图2B）。培养2天后去除细菌重组Colα3（IV）NC1蛋白。每个数据点有n=3个两院制单位。使用不同批次的Sertoli细胞和重组蛋白重复此实验三次，得到了类似的结果。

**图3。**在哺乳动物细胞中生产重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白。从Lenti-X 293T哺乳动物细胞中稳定转染的pTracer-CMV2-Colα3（IV）NC1表达重组Colα3（Ⅳ）NC1结构域蛋白。收集无血清条件培养基，并使用抗Flag M2树脂纯化Colα3（IV）NC1结构域。重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白在亲和层析洗脱的组分2和组分3中检测到，当用考马斯蓝染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析其纯度时，一步纯化到明显的均匀性(A类)以及使用反标记进行免疫印迹(B类)和抗Colα3（IV）NC1抗体(C类). 这些发现是来自使用不同批次重组蛋白的三个不同实验的代表性数据，不包括在2年内建立最佳条件的中试实验，这些实验产生了类似的结果。

**图4。**重组Colα3（IV）NC1结构域蛋白通过改变蛋白分布和/或Sertoli细胞-细胞界面定位介导的对Sertoli电池TJ-通透性屏障功能的破坏。(A类)支持细胞在1.2×10的条件下进行培养⁶细胞/厘米²在第2天，在Matrigel-coated双室单元上建立TJ-通透性屏障，并且在F12/DMEM中包括PBS中30µg/ml重组Colα3（IV）NC1（1µM）。发现NC1结构域重组蛋白的存在与PBS对照（Ctrl）相比显著干扰了TJ-屏障功能，直到第5天移除重组蛋白，并且部分破坏的TJ-壁垒被“重新密封”。*，p<0.05；**，p<0.01。(B类)支持细胞以0.5×10接种⁶细胞/厘米²在F12/DMEM中包含30µg/ml（1μM）的重组NC1结构域前2天。两天后，与PBS对照组（Ctrl）相比，TJ和基础ES蛋白的稳态水平没有显著变化。(C类)此直方图总结了中所示的结果(B类)其中Ctrl的蛋白质水平被任意设置为1。每根棒是n=三个独立实验的平均值±SD。(D类)支持细胞培养于0.045×10⁶细胞/厘米²在Matrigel-coated盖玻片上，用30µg/ml NC1或PBS-Ctrl处理2 d。通过使用相应的一级抗体和Alexa Fluor 555-或488-共轭二级抗体进行双标记免疫荧光分析，固定细胞并对其进行CAR（红色）和ZO-1（绿色）或N-钙粘蛋白（红色）及β-连环蛋白（绿色）染色（见表1）。DAPI（蓝色）显示支持细胞核。在Ctrl细胞中，CAR、ZO-1、N-钙粘蛋白和β-catenin均可见于Sertoli细胞-细胞界面，而用30µg/ml NC1处理细胞导致这些BTB-相关细胞粘附蛋白的分布发生变化，从细胞-细胞接口移动到细胞胞浆中。比例尺，5µm，适用于所有显微照片。本文报告的双标记免疫荧光分析实验的结果是一个代表性实验的结果，该实验使用不同的支持细胞培养物重复了三次，并产生了类似的结果。

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1. Pelletier RM。血液测试屏障：结合通透性、蛋白质和脂质。程序组织化学-细胞化学。2011;46:49–127. doi:10.1016/j.proghi.2011.05.001。-内政部-公共医学
1. Setchell BP，Waites GMB。血液测试屏障。在《生理学手册》中。第五卷第7节，男性生殖系统（编辑：Hamilton，D.W.&Greep，R.O.）143-172（美国生理学会，华盛顿特区，1975年）。

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[9] Setchell BP，Waites GMB。血液测试屏障。在《生理学手册》中。第五卷第7节，男性生殖系统（编辑：Hamilton，D.W.&Greep，R.O.）143-172（美国生理学会，华盛顿特区，1975年）。

[10] Setchell BP，Waites GMB。血液测试屏障。在《生理学手册》中。第五卷第7节，男性生殖系统（编辑：Hamilton，D.W.&Greep，R.O.）143-172（美国生理学会，华盛顿特区，1975年）。

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