Impact of sequence variation in the UL128 locus on production of human cytomegalovirus in fibroblast and epithelial cells

doi:10.1128/JVI.01546-13

。2013年10月；87(19):10489-500.

doi:10.1128/JVI.01546-13。 Epub 2013年7月24日。

UL128位点序列变异对成纤维细胞和上皮细胞中人巨细胞病毒产生的影响

伊萨·穆雷尔¹, 彼得·托马斯克, 加文·S·威尔基, Derrick J Dargan公司, 安德鲁·戴维森, 理查德·斯坦顿

附属公司

PMID： 23885075
预防性维修识别码：项目经理3807394
内政部： 10.1128/JVI.01546-13

UL128位点序列变异对成纤维细胞和上皮细胞中人巨细胞病毒产生的影响

伊萨·穆雷尔等。 J维罗尔。 2013年10月。

。2013年10月；87（19）：10489-500。

doi:10.1128/JVI.01546-13。 Epub 2013年7月24日。

作者

伊萨·穆雷尔¹, 彼得·托马斯克, 加文·S·威尔基, Derrick J Dargan公司, 安德鲁·戴维森, 理查德·斯坦顿

附属

¹英国加的夫大学医学院感染与免疫研究所。

PMID： 23885075
预防性维修识别码：项目经理3807394
内政部： 2012年10月10日/JVI.01546-13

摘要

人巨细胞病毒（HCMV）病毒包膜包含由糖蛋白gH和gL加上UL128位点（UL128L）编码的蛋白质组成的复合物：pUL128、pUL130和pUL131A。UL128L对于髓细胞、上皮细胞和内皮细胞的有效感染是必要的，但限制了成纤维细胞的复制。因此，当临床分离物在成纤维细胞中培养时，UL128L的突变突变被迅速选择。相比之下，细菌人工染色体（BAC）克隆株TB40-BAC4、FIX和TR在UL128L中不包含明显的中断，但据报道，从它们重组的病毒在体外未获得UL128L的突变。我们进行了BAC突变和重组实验，以验证以下假设：这些菌株在BAC克隆之前的传代过程中获得的UL128L中含有细微突变。与含有野生型UL128L的Merlin菌株相比，这三个菌株都产生了较高的无细胞病毒产量。此外，TB40-BAC4和FIX在成纤维细胞中比野生型Merlin在细胞间传播更快，但在上皮细胞中传播更慢。TB40-BAC4和FIX（但不是TR）的差异生长特性映射到UL128L中的单核苷酸替换。TB40-BAC4中的取代降低了UL128的剪接效率，而FIX中的取代导致了UL130中的氨基酸取代。将这些替代物引入Merlin中可以显著增加无细胞病毒的产量，增加成纤维细胞中的细胞间传播，但降低了病毒粒子中pUL128的丰度和上皮细胞感染的效率。这些替换似乎代表UL128L的突变，允许病毒在成纤维细胞中传播，同时保持上皮细胞向性。

PubMed免责声明

数字

图1
BAC-克隆菌株在成纤维细胞中的生长特性。（A）将指示病毒的BAC DNA转染HFFF细胞，然后将其置于半固体覆盖层下。2周后测量牙菌斑大小。显示了平均值和标准偏差。（B）将指示病毒的BAC DNA转染HFFF细胞，并允许感染继续进行，直到单层被破坏。在转染后的每周时间点（p.t.），通过EGFP表达细胞的FACS分析评估感染水平。（C）每周保留一次B组所示感染的上清液，并在HFFF上滴定，以测量无细胞病毒的释放。（如有必要，通过单因素方差分析[ANOVA]对样本进行比较，然后进行Dunnett后验，将每个样本与Merlin-UL128进行比较^重量. *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*< 0.001).

图2
BAC-克隆菌株在上皮细胞中的生长特性。（A）用BAC DNA转染RPE-1细胞以检测指示的病毒，然后将其置于半固体覆盖层下。3周后测量牙菌斑大小。显示了平均值和标准偏差。（B）用BAC DNA转染RPE-1细胞以检测指示的病毒，并允许感染继续进行，直到单层被破坏。在每周的时间点，对细胞进行胰蛋白酶处理，并通过EGFP表达细胞的FACS分析测量感染水平。（C）每周保留一次B组所示感染的上清液，并在HFFF上滴定，以测量无细胞病毒的释放。（如有指示，通过单因素方差分析和邓内特后验对样本进行比较，以将每个样本与Merlin-UL128进行比较^重量. *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*< 0.001).

图3
含其他菌株UL128L的重组梅林病毒的生长特性。将指示病毒的BAC DNA转染HFFF（A）或RPE-1（D）细胞，然后将其置于半固体覆盖层下。2（A）或3（D）周后测量牙菌斑大小。显示了平均值和标准偏差。将指示病毒的BAC DNA转染HFFF（B）或RPE-1（E）细胞，并允许感染继续进行，直到单层被破坏。在每周的时间点，通过EGFP表达（B）估计感染水平，或对细胞进行胰蛋白酶消化，并通过EGFP-表达细胞（E）的FACS分析测量感染水平。（C和F）每周保留面板B和E中显示的感染上清液，并在HFFF上滴定，以提供无细胞病毒释放的测量。（如有指示，通过单因素方差分析和邓内特后验对样本进行比较，以将每个样本与Merlin-UL128进行比较^重量. *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*< 0.001.)

图4
含有TB40-BAC4 UL128 G>T独特核苷酸的病毒特征。（A）用BAC DNA转染RPE-1细胞以检测指示的病毒，然后在半固体覆盖层下培养。三周后测量斑块大小。显示了平均值和标准偏差。（B）用BAC DNA转染RPE-1细胞以检测指示的病毒，并允许感染继续进行，直到单层被破坏。在每周的时间点，对细胞进行胰蛋白酶处理，并使用EGFP表达细胞的FACS分析测量感染水平。（C）同样在每周的时间点，保存上清液并在HFFF上滴定，以测量无细胞病毒的释放。（D）将指示病毒的BAC DNA转染HFFF细胞，然后将其置于半固体覆盖层下。两周后，测量斑块大小。显示了平均值和标准偏差。（如有指示，通过单因素方差分析和邓内特后验对样本进行比较，以将每个样本与Merlin-UL128进行比较^重量. *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*<0.01；***，*P（P）*< 0.001.)

图5
UL128基因图谱和转录本。（A）指出了TB40-BAC4 UL128内含子1中鉴定的唯一A残基的位置，取代了所有其他菌株中存在的C残基。蛋白质编码外显子被遮蔽。（B）用指示的病毒感染HFFF细胞，并在感染后72小时提取总RNA。使用UL128第一和第三外显子中的引物结合进行RT-PCR。这些带对应于以下转录本：（i）未分割的，（ii）缺少内含子2，或（iii）同时缺少内含子1和内含子2。

图6
含有FIX UL130 A>G替代物的病毒的生长特性。（A）用BAC DNA转染RPE-1细胞以检测指示的病毒，并在半固体覆盖层下培养。3周后测量牙菌斑大小。显示了平均值和标准偏差。（B）用BAC DNA转染RPE-1细胞以检测指示的病毒，并允许感染继续进行，直到单层被破坏。在每周的时间点，对细胞进行胰蛋白酶处理，并通过EGFP表达细胞的FACS分析测量感染水平。（C）每周保留一次B组所示感染的上清液，并在HFFF上滴定，以测量无细胞病毒的释放。（D）将指示病毒的BAC DNA转染HFFF细胞，然后将其置于半固体覆盖层下。2周后测量牙菌斑大小。显示了平均值和标准偏差。（如有指示，通过单因素方差分析和邓内特后验对样本进行比较，以将每个样本与Merlin-UL128进行比较^重量. *,*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*<0.01；***，*P（P）*< 0.001.)

图7
BAC克隆株和重组梅林病毒的病毒pUL128含量。（A）培养所示病毒的种群，并在甘油-酒石酸盐梯度上纯化感染性病毒，然后进行Western blotting分析。载荷标准化为gB水平（上面板），并对pUL128（下面板）进行染色。（B）采用Western blotting对与A组相同的样品进行分析。然而，并没有将其归一化为gB含量，而是将病毒粒子负载量最大化，以便于检测每个菌株中的pUL128。

图8
成纤维细胞和上皮细胞的相对感染效率。将指示病毒的库存同时滴定到HFFF或RPE-1细胞上。然后将RPE-1细胞上每种病毒的滴度标准化为HFFF细胞上同一病毒的滴量，该滴度被任意设置为1，从而得出每种毒株的上皮细胞感染的相对效率。数据基于两个独立的实验。（A）与各种梅林病毒相比，TR、TB40-BAC4和FIX的相对感染效率。（B）与TB40-BAC4和Merlin相比，含有整个UL128L或TB40-BAC 4替代物的Merlin的相对感染效率。（C）与FIX和Merlin相比，含有整个UL128L或来自FIX的单核苷酸的Merlin的相对感染效率。

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