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.2013年9月；15(9):1067-78.
doi:10.1038/ncb2804。 Epub 2013年7月21日。

Uba1在Atg7和Atg3非依赖性自噬中的作用

张君凯 1, Bhupendra V Shravage公司, 塞巴斯蒂安·D·海斯, 克里斯汀·鲍尔斯, 瑞秋·T·西敏, J韦德·哈珀, 埃里克·贝克尔
附属公司

Uba1在Atg7和Atg3非依赖性自噬中的作用

张君凯等。 Nat细胞生物学. 2013年9月.

摘要

自噬是一个保守的过程，它将细胞质的成分传递给溶酶体进行降解。由Atg7和Atg3编码的E1和E2酶被认为对涉及泛素样蛋白Atg8的自噬至关重要。在这里，我们描述了一种与Atg7和Atg3无关的自噬途径，该途径有助于肠细胞死亡期间细胞大小的程序性减少。尽管核心自噬途径的多个组成部分，包括Atg8，是自噬和肠中肠细胞收缩所必需的，但Atg7或Atg3功能的丧失并不影响这些细胞过程。相反，泛素化中使用的E1酶Uba1是自噬和细胞缩小所必需的。我们的数据显示，动物体内不同细胞使用不同的自噬程序，并揭示了泛素激活在自噬中的未被认可的作用。

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数字

图1
图1
附件18和附件2在果蝇属中肠。(一)野生型动物三龄早期幼虫中肠细胞的典型差示干涉对比（DIC）显微镜图像第个)，晚三龄幼虫（晚三龄第个)蛹形成期（白色预蛹期，WPP）。(b条)通过在指定阶段野生型动物中肠细胞中形成mCherry-Atg8a点状斑点检测自噬。显示了具有代表性的图像。(c（c）)来自控件的中肠附件18KG03090公司/野生型(附件18/+),n个=14，以及附件18KG03090公司/干膜厚度（3L）6112突变体(Atg18/Df（高度18/Df）),n个=11，通过DIC显微镜分析处于蛹形成的动物。显示了具有代表性的图像。(d日)野生型，对照(第18页KG03090公司/+)和附件18突变体(Atg18/Df（高度18/Df）)中肠细胞大小定量（μm2)在指定阶段，n个=10个动物肠道/基因型，每肠/期测量5个细胞。(e（电子）)中肠细胞的DIC图像附件2EP3697号/野生型控制(附件2/+)和附件2EP3697号/干膜厚度（3L）6091突变体(附件2/Df)蛹期动物。显示了具有代表性的图像。(（f）)细胞大小量化（μm2)来自e（电子）,n个= 12 (附件2/+)和n个= 7 (附件2/Df)动物肠道/基因型，测量5个细胞/肠。(g-j公司)蛹形成后2小时肠细胞的典型TEM图像。(克,我)控制附件18KG03090公司/野生型(附件18/+,克)和附件2第3697页/野生型对照(Atg2公司/+,我)放大后的图像显示围绕线粒体和内质网的双层膜结构（箭头）的细胞。箭头表示自溶体。(小时,j个)附件18KG03090公司/干膜厚度（3L）6112突变体(Atg18/Df（高度18/Df）,小时)单元格和附件2EP3697号/英国国防部(附件2/Df,j个)缺乏自噬结构的突变细胞。量化显示为平均值±标准偏差（s.d.）。比例尺代表20μm(a-c公司和e（电子）)和1微米(g-j公司).
图2
图2
编程缩小是单元自治的，需要附件18和附件1. (一)从表达附件18红外特别是在蛹形成时的DsRed标记细胞克隆中，并通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(b条)定量（μm2)来自一,n个=12个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(c（c）)中肠在所有细胞中表达mCherry-Atg8a，并表达附件18红外特别是在蛹形成后2小时从动物身上切下的GFP标记细胞克隆中。显示了具有代表性的图像。(d日)在蛹形成时从动物身上解剖的中肠含有在g1Δ三维功能缺失突变细胞克隆（缺乏GFP），并通过荧光和DIC显微镜进行分析。野生型（+/+）对照细胞具有较强的GFP和杂合性附件1Δ3D/野生型(Δ3D/+)细胞GFP较弱。显示了具有代表性的图像。(e（电子）)定量（μm2)来自d日,n个= 7 (+/+),n个= 8 (Δ3D/+)、和n个= 8 (Δ3D/Δ3D)动物肠道/基因型，测量1-5个细胞/肠。(（f）)在所有细胞中表达mCherry-Atg8a的动物中肠切片附件1红外特别是在蛹形成后2小时GFP标记的细胞克隆中。显示了具有代表性的图像。(g-j公司)来自野生型3D重建图像的代表性剖视图(克,小时)和附件1击倒(我,j个)早期3个细胞第个幼虫龄期(克,我)在蛹形成时(小时,j个). (k个)细胞体积定量（μm三)来自g-j公司,n个=5个动物肠道/基因型，测量1-5个细胞/肠/期。黑色列：早期3第个幼虫龄期。白柱：蛹形成期。量化显示为平均值±标准差。N.s.：无显著性。比例尺代表20μm。
图3
图3
自噬对于细胞大小的缩小是必要和充分的。(一)在蛹形成时从动物身上解剖出的中肠含有电压ps34Δm22功能丧失突变细胞克隆（缺乏GFP）并通过荧光和DIC显微镜进行分析。野生型（+/+）对照细胞具有更强的GFP和杂合性电压34Δm22/野生型(Δm22/+)细胞GFP较弱。显示了具有代表性的图像。(b条)定量（μm2)来自一,n个=14个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(c（c）)从表达附件8a红外特别是在蛹形成时GFP标记的细胞克隆中，并通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(d日)细胞大小量化（μm2)来自c（c）,n个=10个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(e（电子）)从表达附件12红外特别是在蛹形成时的DsRed标记细胞克隆中，并通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(（f）)细胞大小量化（μm2)来自e（电子）,n个=14个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(克-我)错误表达的三龄早期幼虫的中肠附件1GS10797标准(附件1) (克核和细胞质中的GFP）附件1+附件8a红外(小时)或两者兼而有之附件1+附件7红外(我)并染色以检测所有细胞皮层上的大圆盘（绿色）。显示了具有代表性的图像。(克'和我'）在所有细胞中表达mCherry-Atg8a的中肠DIC图像，附件1(克'），和附件1+附件7红外(我’）在GFP标记的细胞克隆中。mCherry-Atg8a点在插图中显示。显示了具有代表性的图像。量化显示为平均值±标准差。比例尺表示20μm。
图4
图4
附件7程序化细胞大小减少和自噬不需要。(一)在蛹期从动物身上解剖的中肠含有附件7第4天功能丧失突变细胞克隆（缺乏GFP）并通过荧光和DIC显微镜进行分析。野生型（+/+）对照细胞具有更强的GFP和杂合性附件7第4天/野生型(第4天/+)细胞GFP较弱。显示了具有代表性的图像。(b条)细胞大小量化（μm2)来自一,n个=8个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(c（c）)中肠在所有细胞中表达mCherry-Atg8a附件7第4天蛹形成后2小时失去功能的克隆细胞（缺乏GFP）。显示了具有代表性的图像。(d日)对照组所有细胞中胃盲肠表达GFP-Atg8a(附件7第30天/第14天)和附件7突变体(附件7第77天/第14天)动物。显示了具有代表性的图像。(e（电子）)GFP-Atg8a穿孔数的量化d日,n个=31个动物肠道/基因型，在图像域/肠道中量化斑点。(（f）)表达GFP-Atg5的中肠在具有附件7第4天蛹形成时失去功能的克隆细胞（缺乏RFP）。显示了具有代表性的图像。(克,小时)蛹形成后2小时肠细胞的典型TEM图像。箭头表示自溶体。(克)控制(附件7第30天/第14天)和(小时)附件7突变体(附件7第77天/第14天)细胞都含有自噬结构。(小时)放大附件7线粒体周围的双膜自噬体（箭头）的突变细胞图像。量化显示为平均值±标准差。N.s.：无显著性。比例尺代表20μm(一,c（c）,d日、和（f）)和1微米(克,小时).
图5
图5
线粒体的清除需要自噬(一)线粒体数量的量化第18页控制(第18页KG03090公司/野生型）和突变型(附件18KG03090公司/干膜厚度（3L）6112)或附件7控制(附件7第30天/第14天)和突变型(附件7第77天/第14天)TEM图像。线粒体从2个不同的25μm处进行定量2每个细胞的区域来自至少3种不同动物/基因型的每只动物的2个细胞。(b、 c（c）)三龄早期幼虫的中肠解剖(b条)或蛹形成时(c（c）)在所有细胞中表达GFP标记的线粒体，并含有附件1Δ3D功能丧失突变细胞克隆（缺乏RFP）。野生型对照细胞具有较强的RFP，杂合细胞具有较弱的RFP。显示了具有代表性的图像。量化显示为平均值±标准差。N.s.：无显著性。比例尺代表20μm。
图6
图6
Uba1号机组是中肠细胞程序化缩小和自噬所必需的。(一)从表达Uba1号机组红外特别是在蛹形成时GFP标记的细胞克隆中，并通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(b条)细胞大小量化（μm2)来自一,n个=16个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(c（c）)在蛹期从动物身上解剖的中肠含有Uba1号机组H33小时功能缺失突变细胞克隆（缺乏RFP），并通过荧光和DIC显微镜进行分析。野生型（+/+）对照细胞具有更强的RFP和杂合性Uba1号机组H33型/野生型(H33型/+)单元格的RFP较弱。显示了具有代表性的图像。(d日)定量（μm2)来自c（c）,n个= 8 (+/+),n个= 11 (H33型/+)、和n个=11 (H33/H33)动物肠道/基因型，测量1-5个细胞/肠。(e（电子）)在蛹期从动物身上解剖的中肠含有Uba1号机组H33型功能丧失的MARCM突变细胞克隆（GFP-阳性）也在所有细胞中表达mCherry-Atg8a，并通过荧光显微镜进行分析。对照野生型和杂合细胞没有GFP。显示了具有代表性的图像。(（f）)中肠在肠细胞（较大的细胞核）中表达GFP-Atg5，并且具有Uba1号机组H33型荧光显微镜分析蛹形成时功能丧失的克隆细胞（缺乏RFP）。显示了具有代表性的图像。(克)在蛹期从动物身上解剖的中肠含有Uba1号机组H33型用p62抗体染色并用荧光显微镜分析的功能丧失的MARCM突变细胞克隆（GFP阳性）。对照野生型和杂合细胞没有GFP。显示了具有代表性的图像。(小时)从表达日期7是蛋白酶体β2亚基的一个显性温度敏感突变，特别是在蛹形成时GFP标记的细胞中，并通过荧光和DIC显微镜进行了分析。显示了具有代表性的图像。(我)细胞大小量化（μm2)来自小时,n个=6个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。量化显示为平均值±标准差。N.s.：无显著性。比例尺代表20μm。
图7
图7
的作用Uba1号机组中肠自噬。(一和b条)使用Atg8a对Uba1和Atg7进行E1充电分析(一)或Ub(b条),n个=2个独立分离蛋白质的实验和分析。在存在或不存在β-巯基乙醇的情况下，用His-tagged Atg8a或Ub孵育标记杆状病毒表达的E1s，并通过电泳分离和印迹。用抗Flag抗体检测带移。分子量阶梯如图所示。显示了具有代表性的图像。分子量：Flag-Uba1 135 kDa、Flag-Atg7 81 kDa，His-Atg8a 29 kDa和Ub 9 kDa。(c（c）)野生型蛹形成时的中肠蛋白提取物，附件7突变体(附件7第77天/第14天)和附件8(附件8KG07569公司)抗Atg8和抗Tubulin印迹的突变体，n个=3个独立的生物实验。显示了具有代表性的图像。(d日)来自控件的中肠附件310/野生型(附件3/+)、和附件310/Df（3L）猫突变体(地址3/Df)通过DIC显微镜分析蛹形成时的动物。显示了具有代表性的图像。(e（电子）)细胞大小量化（μm2)来自d日,n个= 11 (附件3/+)和n个= 9 (地址3/Df)动物肠道/基因型，测量5个细胞/肠。(（f）)3月初解剖的中肠第个错误表达的龄幼虫在g1GS10797(在g1)和附件3红外仅在DsRed标记的细胞克隆中，通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(克)从表达附件4DN（公称直径）特别是在蛹形成时的DsRed标记细胞克隆中，并通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(小时)细胞大小量化（μm2)来自克,n个=10个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(我)在所有细胞中表达mCherry-Atg8a的动物中肠切片Ub（英国）红外特别是在蛹形成时GFP标记的细胞克隆中。显示了具有代表性的图像。(j个)从表达Ub（英国）红外特别是在蛹形成时GFP标记的细胞克隆中，并通过荧光和DIC显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。(k个)细胞大小量化（μm2)来自j个,n个=12个动物肠道/基因型，每个肠道测量1-5个细胞。(我,米)三龄早期幼虫的中肠附件1GS10797标准(附件1)野生型GFP阳性细胞克隆中的错误表达(我)或aUba1号机组H33型功能丧失的MARCM突变细胞克隆（GFP-阳性）(米)并通过荧光和DIC显微镜进行分析。控制野生型和杂合型Uba1号机组H33型/野生型细胞没有GFP。显示了具有代表性的图像。(n个)定量（μm2)来自我和米,n个=22（对照），n个= 16 (附件1)、和n个=6 (附件1+优步1H33小时)动物肠道/基因型，测量到1-5个细胞/肠道。对照细胞的量化(我,米)因为基因相同，所以被合并。量化显示为平均值±标准差。N.s.：无显著性。比例尺代表20μm。
图8
图8
Uba1号机组是清除线粒体所必需的(a、 b条)三龄早期幼虫的中肠解剖(一)或蛹形成时(b条)在肠细胞（较大的细胞核）中表达GFP标记的线粒体，并含有Uba1号机组H33型功能丧失突变细胞克隆（缺少RFP）。野生型对照细胞具有较强的RFP，杂合细胞具有较弱的RFP。显示了具有代表性的图像。(c（c）)在蛹形成时解剖的中肠表达Uba1号机组红外（细胞核和细胞质中的GFP），并用ATP合酶复合物V（ATPV）染色检测所有细胞中的线粒体。显示了具有代表性的图像。(d-f型)典型的免疫透射电镜图像Uba1号机组红外蛹期克隆细胞。Uba1号机组红外-表达细胞含有金颗粒，而对照细胞缺乏金颗粒(d日). 控制细胞在细胞质中有许多自溶体（箭头）和少数线粒体（星号），而Uba1号机组红外-表达细胞具有大量线粒体和少量自噬结构。比例尺代表20μm(a-c公司)和1微米(d-f型).
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中的注释

  • 自噬：中肠自噬。
    Wrighton KH公司。 Wrighton KH公司。 Nat Rev Mol细胞生物学。2013年9月；14（9）:546。doi:10.1038/nrm3466。Epub 2013年8月7日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2013 PMID：23921334 没有可用的摘要。

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