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.2013;9(7):e1003588。
doi:10.1371/journal.pgen.1003588。 Epub 2013年7月4日。

染色体9p21的ANRIL非编码RNA中的Alu元素通过基因网络的反调节调节致动脉粥样硬化细胞功能

附属公司

染色体9p21的ANRIL非编码RNA中的Alu元素通过基因网络的反调节调节致动脉粥样硬化细胞功能

莱斯卡·M·霍尔特等。 公共科学图书馆-基因. 2013.

摘要

冠状动脉疾病的染色体9p21(Chr9p21)位点在第一次全基因组关联中被确定,是目前已知的动脉粥样硬化最强的遗传因素。Chr9p21编码INK4基因座(ANRIL)中的长非编码RNA(ncRNA)反义非编码RNA。ANRIL表达与Chr9p21基因型相关,与动脉粥样硬化严重程度相关。在这里,我们报道了ANRIL调节反式靶基因的分子机制,从而导致细胞增殖增加、细胞粘附增加和凋亡减少,这些都是动脉粥样硬化形成的基本机制。重要的是,反调节依赖于标记ANRIL靶基因启动子的Alu基序,并在ANRIL RNA转录物中反映出来。ANRIL结合的Polycomb组蛋白,在整个基因组中高度富集Alu基序,并在ANRIL过度表达后被招募为目标基因的启动子。ANRIL中Alu基序的功能相关性通过缺失和突变、逆转反调节和致动脉粥样硬化细胞功能得到证实。在2280名患有和不患有冠心病的个体中证实了ANRIL调节网络,并在携带Chr9p21风险等位基因患者的原代细胞中进行了功能验证。我们的研究为ANRIL在Chr9p21的促热效应提供了分子机制,并提示Alu元素在长ncRNAs的表观遗传基因调控中的新作用。

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数字

图1
图1。带批注的ANRIL公司Chr9p21区域的转录物、转录物结构和ANRIL公司具有Chr9p21基因型的亚型。
(A) Chr9p21单倍型结构(HapMap CEU,r2)和核心动脉粥样硬化区(rs12555547和rs1333050之间)。(B) 最初发现的外显子ANRIL公司转录本及其在Chr9p21区域的相对位置*当前注释的完整列表ANRIL公司异构体如图S1B所示。(C)ANRIL公司通过RACE和PCR扩增鉴定的转录本(L1-L17)。共鉴定出4个具有4个不同转录末端的主要亚型组。外显子发生频率/亚型组采用彩色编码,以%表示。ANRIL1-4号机组表示包含外显子的高度表达的共有转录本,这些外显子在各自亚型组的转录本中超过50%(红色)。虚线表示转录特异性qRT-PCR分析的位置。(D) 研究设计ANRIL公司表达并与Chr9p21相关。(E) 协会ANRIL公司人类PBMC、全血和血管组织中含有Chr9p21的亚型(rs10757274、rs2383206、rs2393297和rs10757270定义的效应、变化/风险等位基因百分比)。
图2
图2。ANRIL公司调节t细胞的基因表达rans公司并影响细胞粘附、代谢活性、增殖和凋亡。
(A) 4份共识成绩单ANRIL公司通过RACE和PCR鉴定的亚型组(图S1)。虚线表示转录物特异性qRT-PCR测定的位置。(B) RT-PCR确认ANRIL公司在稳定的ANRIL1-4细胞系中过度表达。每个3–4个细胞株ANRIL公司建立了亚型,未发现对家政基因表达的影响(内参(文学士);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)). (C) 的热图ANRIL变速器-与B组相对应的受调控转录本。显示了与病媒控制相关的平均下调(<0.5倍,红色)和上调(>2倍,绿色)转录本。(D–F)附着力ANRIL公司PBS-、Matrigel-和胶原蛋白涂层孔的过表达细胞系(P(P)与载体对照相比,ANRIL1、2、3、4的比较<0.01)。(G–I)细胞增殖和代谢活性由(G)绝对细胞数决定(*/# P(P)ANRIL2和ANRIL4与载体对照组相比<0.05),(H)葡萄糖利用率,(I)活力测定。(J–L)凋亡由(J)AnnexinV阳性细胞、(K)caspase活性和(L)caspase-3染色确定。(H–K)P(P)ANRIL2和ANRIL4与病媒控制相比<0.05。(M–O)RNAi对ANRIL公司(*P(P)<0.05; SCR-加扰控制)。(D–K)每个3-4个生物复制品池至少进行三次测量。有关实验设置和P(P)-值请参见表S3。(M–O)n = 3/组。siRNA敲除的验证如图S6所示。误差条表示s.e.m。
图3
图3。ANRIL公司结合PRC1和2蛋白,并将CBX7和SUZ12招募到目标基因的启动子。
(A,B)RNA免疫沉淀(RIP)后qRT-PCR显示ANRIL公司与PRC结合,但不与(A)ANRIL2和(B)ANRIL4细胞中的CoREST/REST蛋白结合。与输入控制相关的ANRIL副本以(A)蓝色和(B)红色给出,核ncRNA1号机组(白色)作为阴性对照。rIgG/mIgG/gIgG-兔子/老鼠/山羊IgG控件。错误条指示s.e.m.(C,D)SUZ12在ANRIL公司在(C)载体控制细胞系和(D)BGO3细胞(GSM602674)中,上调(绿色)、下调(红色)和非上调(黑色)基因。TSS-转录起始位点。(E,F)ANRIL公司上调基因启动子中(E)SUZ12和(F)CBX7结合过度表达(矢量控制-虚线vs.ANRIL2-直线)。(G) 反转ANRIL变速器-RNAi对ANRIL2细胞中SUZ12和CBX7的调节。SCR加扰siRNA控制。
图4
图4。启动子中Alu基序的鉴定ANRIL变速器-调节基因和ANRIL公司RNA及其与PcG蛋白结合的空间关系。
(A) 基因启动子(5 kb)中的DNA基序反式-代表Alu-DEIN重复序列的受调控基因。(B) 启动子中Alu基序的数量反式-和非规范转录本(n/5kb)。(C) ChIP-seq富集SUZ12和CBX7与Alu基序远端的结合,表明基序发生与PcG蛋白结合的特定空间关系。RPM-每百万次映射读取读取数,CTR-随机DNA控制序列。(D) 在BGO3细胞的独立数据集中,Motif-associated SUZ12信号出现峰值。只有在采用多重匹配策略时,实际信号峰值才变得明显。(E) 使用严格的唯一匹配策略,可以在图案的下游看到显著的信号减少。请注意(D,E)中y轴缩放的差异。(F) 使用维也纳RNA包预测ANRIL2的二级RNA结构。在最小自由能结构中,Alu-DEIN基序位于干环结构中(箭头)。(G) RIP演示ANRIL公司在ANRIL2(蓝色)和ANRIL4(红色)细胞中与组蛋白H3(H3)和组蛋白3(H3K27me3)的三甲基赖氨酸27结合。1号机组作为阴性对照。mIgG/rIgG-鼠/兔IgG对照。误差条表示s.e.m。
图5
图5。Alu图案在ANRIL公司RNA功能。
(A) 细胞系过度表达ANRIL2公司(ANRIL2a、2b、2c)和ANRIL4公司(ANRIL4a,4b)没有方框突出显示的Alu基序序列。使用qRT-PCR分析验证过表达。(B) 上调的逆转(TSC22D3型)和(C)下调(COL3A1系列)第页,共页ANRIL公司与ANRIL2和ANRIL4相比,ANRIL2a-2c和ANRIL 4a、4b中靶基因mRNA的表达。过度表达突变体的细胞系中(D)细胞粘附、(E)细胞凋亡和(F)增殖的逆转ANRIL公司亚型。(G) 含有Alu基序突变形式的稳定细胞系ANRIL2公司48个碱基对Alu基序中核苷酸交换的位置(0、25%、33%和100%)用红色表示反式-与ANRIL2相比,突变细胞系的调节。(J) 突变细胞系中的细胞粘附、(K)凋亡和(L)增殖。(B、C、H、I、F、L)3-4个生物复制品/亚型。(D,E,J,K)每2–3个生物复制品池进行四次重复测量。误差条表示s.e.m。
图6
图6。的验证ANRIL公司-原代细胞中的相关细胞效应和分子支架示意图ANRIL公司.
(A) 由rs10757274、rs2383206、rs2383297和rs10757278(n = 8) 粘附力增加(P(P) = 0.001)和(B)减少细胞凋亡(P(P) = 0.008)与携带保护性等位基因(n)的细胞相比 = 8). (C) 分子支架示意图ANRIL公司通过Alu基序的潜在染色质-RNA相互作用介导。

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出版物类型

赠款和资金

本研究得到了MSD SHARP&DOHME奖学金(MSD-Stipendium 2010-Arteriosklerose,Wilhelm-Stoffel-Stipendium;LMH)和LIFE–莱比锡大学文明疾病研究中心(LMH SH DL MS KK KF FB SG GS PFS JT DT)的支持。LIFE由欧盟、欧洲区域发展基金(ERDF)和萨克森自由州在其卓越倡议范围内资助。部分研究由德国教育和研究部通过NGFN-plus(DT)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。