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.2013年9月9日；14(9):3047-54.
doi:10.1021/bm4006112。 Epub 2013年8月7日。

RGD浓度梯度水凝胶中离散和连续培养条件对人骨髓间充质干细胞系选择的影响

劳拉·A·史密斯·卡拉汉 1, Gina M Policastro女士, 莎伦·伯纳德, 艾琳·P·齐尔德斯, 罗娜·博彻（Ronna Boettcher）, 马修·贝克尔
附属公司

RGD浓度梯度水凝胶中离散和连续培养条件对人骨髓间充质干细胞系选择的影响

劳拉·A·史密斯·卡拉汉等。 生物大分子. .

摘要

干细胞在含有来源于天然组织的信号基团的底物上培养时显示出谱系特异性分化。在这个过程中，一个独特的决定因素是信号基序的集中。虽然几个小组一直在积极工作，以确定控制分化过程的具体因素、浓度和机制，但许多小组一直在寻求组合和梯度方法，以优化下一步发展所需的多种化学和物理参数。然而，在梯度培养基和离散培养基中培养的人类间充质干细胞的细胞行为和分化之间没有直接的比较，这量化了由于培养系统之间的设计差异而导致的细胞产生的可溶性因子所造成的差异的影响。本研究检测了RGD浓度梯度为0-14mM的连续和离散聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）水凝胶中人间充质干细胞的分化，以研究不同培养条件对干细胞行为的影响。研究发现，无论RGD浓度如何，培养条件都会影响所检测的每一种成骨细胞（碱性磷酸酶、Runx 2、1型胶原、骨蛋白和钙含量）和成脂标志物（油红和过氧化物酶体增殖物激活受体γ）。只有在连续梯度培养中，RGD浓度影响人类间充质干细胞谱系承诺，低RGD浓度比高RGD浓度表现出更高的成骨分化。相反，高RGD浓度比低RGD浓度表达更高的脂肪分化。细胞骨架肌动蛋白组织仅受低RGD浓度培养条件的影响，这表明它在观察到的谱系承诺差异中的作用有限。因此，在设计实验时，需要考虑离散策略与梯度策略在高通量实验中的作用，因为我们表明，尽管基础支架具有相似的材料和化学性质，但各自的策略会改变细胞结果。

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利益冲突声明

笔记

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
通过（A）在对应RGD生物利用度的梯度内，通过（Lowry）和金纳米粒子标记受体模拟物对RGD进行量化，总结水凝胶梯度内的RGD浓度。（B） 结合到生物利用RGD的金颗粒受体模拟肽每10 mm（具有相应的RGD浓度）的亮场显微镜图像。比例尺=50μm.（C）水凝胶特性的流变特性和网目尺寸计算。
图2
图2
梯度培养条件对人骨髓间充质干细胞系选择的影响。（A） 表达碱性磷酸酶的细胞分数。（B） 脂肪空泡染色的细胞分数。每10 mm人骨髓间充质干细胞培养3周后（C）连续和（D）离散进行Runx2表达的免疫荧光成像：（E）连续，（F）离散进行PPAR-γ3周后表达。比例尺=5μm.相应RGD浓度显示在相应图像下方。*表示时间点梯度位置的离散值和连续值之间的p值<0.05。#表示梯度位置和2w C 35 mm（12.2 mm RGD）之间的p值<0.05。$表示梯度位置和2w C 5 mm（4.4 mm RGD）之间的p值<0.05。**表示梯度位置和2w D 5 mm（4.4 mm RGD）之间的p值<0.05表示梯度位置和2w D 10 mm（5.7 mm RGD）之间的p值<0.05表示梯度位置和3w C 40 mm（14 mm RGD）之间的p值<0.05。
图3
图3
在培养3周后，从不同培养条件中提取的油红染料的定量。*表示第页-时间点梯度位置的离散值和连续值之间的值<0.05表示第页-梯度位置和2w C 40 mm（14 mm RGD）之间的值<0.05。@表示第页-梯度位置和2w C 45 mm（16.1 mm RGD）之间的值<0.05。
图4
图4
培养条件对培养3周后各样品中胶原蛋白含量的影响。（A） 羟脯氨酸定量，（B）免疫荧光中每个细胞1型胶原蛋白表达的平均强度，以及（C）免疫荧光的每个细胞IV型胶原蛋白的平均强度。对（D）连续和（E）离散样本进行1A型胶原蛋白染色，对（F）连续样本和（G）离散样本每隔10 mm进行IV型胶原蛋白表达染色。相应的RGD浓度显示在相应的图像下方。比例尺=25μm.*表示时间点梯度位置离散值和连续值之间的p值<0.05。#表示梯度位置和RGD浓度的2周和3周时间点之间的p值<0.05表示梯度位置和2w C 20 mm（7.2 mm RGD）之间的p值<0.05。
图5
图5
成熟成骨细胞分化的标志物3周后表达骨唾液蛋白的（A）连续和（B）离散样品的图像。每10 mm拍摄一次图像。相应的RGD浓度显示在相应图像的下方。比例尺=5μm.（C）每细胞骨盐蛋白表达的平均强度（D）钙定量。*表示时间点梯度位置的离散值和连续值之间的p值<0.05。#表示梯度位置和RGD浓度的2周和3周时间点之间的p值<0.05表示梯度位置和2w C 20 mm（7.2 mm RGD）之间的p值<0.05。
图6
图6
在（A）连续梯度和（B）离散梯度培养3周后，荧光显微镜图像显示肌动蛋白（红色）、维酮（绿色）和核（蓝色）染色。沿着梯度每10毫米拍摄一次图像。相应的RGD浓度显示在相应的图像下方。比例尺=5μ米。
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