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.2013年10月；110(7):1722-31.
doi:10.1152/jn.00319.2013。 Epub 2013年7月10日。

Sniffer贴片激光解锁反应（SPLURgE）：变构受体调节和神经递质清除的区域差异分析

凯瑟琳·克里斯蒂安 1, 约翰·R·胡格纳德
附属公司

嗅探斑贴激光非激活反应（SPLURgE）：变构受体调节和神经递质清除的区域差异分析

凯瑟琳·克里斯蒂安等。 神经生理学杂志. 2013年10月.

摘要

变构调节剂通过积极或消极地改变这些受体对各自神经递质的有效反应，对神经递质受体发挥作用。γ-氨基丁酸（GABA）A型离子性受体（GABAAR）是变构调节剂（如苯二氮卓类、神经甾醇类和巴比妥类）的主要靶点。由于缺乏评估脑切片中此类药物的定位和功能的技术，对产生类似作用的物质的分析受到阻碍。在这里，我们描述了嗅探器斑片激光非激活响应（SPLURgE）的测量，该响应将嗅探斑片记录配置与笼状GABA的激光光解相结合。该方法能够检测脑切片离散区域内内源性的变构GABAAR调节剂，并允许应用具有时空控制的外源性GABA，而不会改变切片内内源性调节剂的释放和定位。在这里，我们展示了这项技术的发展和用于测量丘脑不同区域的变构调节。该技术的应用将有助于确定对特定类别的神经元或受体缺乏调节作用是由于对变构调节不敏感还是缺乏内源性配体的局部释放。我们还证明，该技术可用于研究GABA扩散和吸收。因此，该方法提供了一种生物传感器检测方法，用于快速检测内源性GABAAR调节剂，并有可能帮助研究变构调节剂对其他类神经递质受体（如谷氨酸、乙酰胆碱或甘氨酸受体）产生影响。

关键词：GABA；脑切片；电生理学；神经调节；外部补丁。

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数字

图1。
图1。
丘脑网状核（nRT）电刺激引起的丘脑GABA释放可以通过放置在VB中的腹叶核（VB）膜片检测到，但在nRT中不能检测到。A类：丘脑水平切片的显微镜图像示例，显示nRT（用白色虚线勾勒）和VB的位置。校准条，250μm。IC，内囊；纹状体。B：从VB神经元中取出并放回VB的外部嗅探器贴片的代表性平均诱发GABA能反应（nRT中的35V刺激）。黑点表示应用于nRT的电刺激时间。所示的响应是8块测试补丁中5块中观察到的典型响应。C类：从VB神经元提取的贴片的代表性平均响应，然后放入nRT（40-V刺激）。从测试的8个补丁中选择示例。为了清晰起见，电刺激伪影被截断。D类：堆叠条形图，显示当置于VB或nRT中时，从VB神经元中提取的嗅探器贴片对电刺激的响应速度*P（P）<0.05，Fisher精确检验。
图2。
图2。
当贴片位于切片上方时，VB贴片对笼状GABA激光光解的响应。A类：在存在100μM笼式GABA的情况下，VB修补程序中的非笼式响应的典型示例。灰色轨迹表示每10秒触发的单个扫描，黑色轨迹是合成平均值。上的数字左边灰色痕迹表示所引发的反应的顺序。hν，1-ms紫外线激光刺激。B：中的示例中每个扫描的单个未捕获抑制性突触后电流（IPSC）半宽度和振幅值A类.ISI，刺激间隔。C类：对第三次激光刺激的响应的未封存IPSC半宽度或振幅与对第一次刺激的响应相应值的平均+SE比率，在6个补丁中平均。D类：每30秒触发一次非缓存响应的VB补丁的单个非缓存IPSC振幅值。E类：每60秒引发一次非缓存响应的VB补丁的单个非缓存IPSC振幅值。F类：对第三次激光刺激的响应，未加保护的IPSC振幅与第一次刺激的相应值的平均+SE比率，在4个补丁（30-s ISI）或3个补丁（60-s ISI）中平均*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，成对t吨-贴片内测试与第一次刺激反应。
图3。
图3。
将补片置于切片上方时，nRT补片对笼状GABA激光光解的响应。A类：存在100μM笼状GABA的nRT贴片中平均无盒响应的典型示例。从测试的3个补丁中选择示例。hν，1-ms紫外线激光刺激。B：在存在1 mM笼状GABA的情况下，在nRT补丁中每10秒获得一次非装箱响应的代表性示例（来自8个补丁）。灰色轨迹表示单个扫描，黑色轨迹表示复合平均值。上的数字左边灰色痕迹的数量表明了引发反应的顺序。C类：示例中每个扫描的单个未封存IPSC半宽和振幅值B.D类：对第三次激光刺激的响应的未封存IPSC半宽度或振幅与对第一次刺激的响应相应值的比率，平均值为5个补丁*P（P）<0.05，成对t吨-贴片内测试与对第一次刺激的反应。
图4。
图4。
未老化的GABA响应衰减在全细胞模式和隔离贴片模式中发生的情况类似，并且不能通过在移液管中加入Mg-ATP来挽救，但在引入新的笼式GABA溶液后，随着每次连续记录，衰减程度逐渐增加。A类：连续试验中的平均±SE未加Caged IPSC振幅标准化为当细胞内充满对照CsCl内溶液或CsCl-外加5 mM MgATP时，在10-s ISI下获得的每个细胞的第一个未加Cage反应振幅。B：通过10次连续试验的标准化振幅值，得出最佳拟合线斜率的每个单元格的单个值。最佳拟合的线性回归线表明，新鲜笼子GABA置换后的记录顺序与衰减响应斜率呈正相关。实线表示所有控制值的最佳拟合线，虚线表示移液管溶液中用MgATP记录的细胞的最佳拟合直线*P（P）<0.05，成对t吨-细胞内测试与第一刺激反应(A类); 皮尔逊相关(B).
图5。
图5。
GABA扩散和摄取分别调节嗅探贴片激光非切割响应（SPLURgEs）的早期和晚期衰减动力学。A类：VB补丁中SPLURGE的典型示例，当补丁放回VB中的切片时，存在100μM笼式GABA。灰色轨迹表示每10秒触发的单个扫描，黑色轨迹表示复合平均值。上的数字左边灰色痕迹的数量表明了引发反应的顺序。hν，1-ms紫外线激光刺激。请注意，所有响应都是在贴片位于切片内时获得的。B：中示例中每个扫描的单个SPLURgE半角值A类.C类和D类：在控制条件下，放置在切片上方（黑色记录道）和VB切片中（灰色记录道）的VB补丁的平均SPLURgE记录道(C类)或在药物GABA转运体（GAT）阻断的条件下(D类). 在100μM笼状GABA存在下获得示踪，并将其归一化为峰值振幅。E类和F类：平均值±SE SPLURgE半宽度(E类)和90–10%的衰减时间(F类)作为的函数z（z）-在控制条件下（4个贴片）或存在GAT阻滞剂（4个贴片）时，放置在VB内的VB贴片的移液管相对于脑片表面的轴位置。将响应归一化为每个贴片切片上方−50μm处获得的值*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，成对t吨-贴片内测试与切片上−50μm处的响应；#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01,###P（P）< 0.001,t吨-测试与控制在各自位置深度；†P（P）<0.05，成对t吨-在补丁内测试，与相应位置深度的标准化90–10%衰减时间值相比。
图6。
图6。
从VB神经元中提取并放置在nRT中的补片中的SPLURgE增强对氟马西尼（FLZ）敏感，并且依赖于补片放置的深度。A类：在存在100μM笼状GABA的情况下，放置在VB或nRT中的代表性单个VB补片的平均SPLURgE轨迹，归一化为峰值振幅。hν，1-ms紫外线激光刺激。B和C类：平均值±SE SPLURgE半宽度(B)和90-10%的衰减时间(C类)作为的函数z（z）-移液管相对于脑切片表面的轴线位置，例如VB贴片放置在nRT中，处于控制条件下（4个贴片）或存在1μM FLZ（4个贴片）。将响应归一化为每个贴片切片上方−25μm以上获得的值*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，成对t吨-贴片内测试与切片上方−25μm以上的响应；#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01,###P（P）< 0.001,t吨-在各个位置深度的测试与控制；††P（P）<0.01配对t吨-在补丁内测试，与相应位置深度的标准化90–10%衰减时间值相比。
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引用人

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工具书类

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