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比较研究
.2013年8月15日;191(4):1865-1862。
doi:10.4049/jimummol.1203070。 Epub 2013年7月10日。

MyD88依赖性信号通路在小鼠肌炎模型中的功能冗余

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比较研究

MyD88依赖性信号通路在小鼠肌炎模型中的功能冗余

费尔南德斯·伊琳娜等等。 免疫学杂志. .
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摘要

我们以前已经证明,在不同的同类小鼠株中,注射细菌表达的小鼠组织酰tRNA合成酶(HRS)会触发华丽的肌肉炎症(相对于适当的控制蛋白)。因为即使在缺乏对HRS的适应性免疫反应的情况下也会发生严重的疾病,我们试图确定先天性免疫信号成分对HRS诱导的肌炎模型起作用。体外刺激实验显示,转染TLR2或TLR4的HEK293细胞经HRS介导激活,其兴奋能力超过其他细菌表达的融合蛋白。与TLR信号通路的这种明显的功能冗余相对应,B6.TLR2(-/-)和B6.TLR4(-/-)单基因敲除小鼠的HRS免疫可产生与C57BL/6野生型小鼠相当的肌肉组织淋巴细胞浸润。TLR4/-R4引起的TLR2和TLR4引起的炎症的严重性显著降低。补充亚组分分析表明,通过这些MyD88依赖性TLR途径,在体外和体内信号传递中,HRS的aa 60-90是绝对必需的,部分通过能够激活特定TLR的外源配体的优先结合来介导。总的来说,这些实验表明,多个MyD88依赖性信号级联参与了HRS诱导的肌炎模型,强调了HRS的抗原性多功能性,并证实了先天免疫在该系统中的重要性。

数字

图1
图1。B6.MyD88的MA/MBP免疫−/−小鼠不能诱发肌炎
A) 显微照片(放大400倍)描绘了从B6.MyD88提取的具有代表性的苏木精和伊红染色的肌肉组织切片−/−88车型年款−/−)肌注MA/MBP(小鼠HRS氨基端151个氨基酸与麦芽糖结合蛋白(MBP))免疫后17天。随附的条形图显示了从n=10 B6.MyD88开始的肌肉炎症的平均严重程度评分−/−n=10只C57BL/6小鼠,误差线代表扫描电镜。B) IgG抗鼠HRS抗体的相对滴度如图所示,其中个别数据点代表基于ELISA的调整OD测量450值(OD450mHRS(1µg/ml)-外径450无抗原)使用从n=10 B6.MyD88获得的第17天血清(1:1000稀释)−/−n=10只C57BL/6小鼠。水平杆表示平均外径450每个应变的值。
图2
图2。TLR转染HEK293细胞的体外刺激
A) 条形图描绘了不同重组蛋白与表达所示细胞表面Toll样受体(TLRs)的HEK293细胞过夜共孵育产生的相对IL-8生成量(pg/ml,用ELISA测量)。为了便于解释,已从单个蛋白质诱导的值中减去未经刺激的TLR转染细胞(TLR2=44 pg/ml、TLR4=232 pg/ml和TLR5=226 pg/ml)分泌IL-8的背景水平。蛋白质浓度从0.5µg/ml(TLR4和TLR5刺激)到3.0µg/ml(TLR2刺激),其中MBP=麦芽糖结合蛋白,MA/MBP=与MBP融合的小鼠HRS的氨基酸1–151,70 kDa/MBP=与MBP融合的U1RNP复合物的70kDa成分。鞭毛蛋白(100ng/ml)作为刺激TLR5转染HEK293细胞的阳性对照。误差线表示SEM值。B) 这些图显示了TLR2-和TLR4转染的HEK293细胞中IL-8的相对产生量(pg/ml),在使用过滤灭菌的重组MA/MBP(MA vs.MA gp)和凝胶纯化版本(在面板A中指定的浓度下)刺激后。误差条再次表示SEM值。面板A和B中描述的所有分析至少代表两个独立实验。
图3
图3。肌细胞浸润中TLR2和TLR4表达的免疫组化分析
显微照片(400x)显示了MA/MBP免疫C57BL/6小鼠脱蜡肌肉组织的免疫组化染色。标签表明使用针对CD3、CD45/B220、CD11c、TLR2和TLR4的抗体。为了便于说明,省略了相应的同型控制。
图4
图4。MA/MBP免疫诱导TLR2-和TLR4缺陷小鼠肌炎
A) 显微照片(左栏100倍,右栏400倍)显示用MA/MBP肌肉免疫后17天获得的具有代表性的苏木精和伊红染色的肌肉组织。B) 随附的条形图描述了n=10 B6.TLR2肌肉炎症的平均严重程度评分−/−(TLR2)−/−),n=15 C57BL/6,n=5 B6.TLR4−/−(TLR4)−/−)鼠标;误差线反映扫描电镜。C) 点图显示了基于酶联免疫吸附法(ELISA)对从A组所列小鼠获得的第17天血清(1:1000稀释度)中IgG抗mHRS水平的评估,而个别数据点代表调整后的OD450值(OD450mHRS(1µg/ml)-外径450无抗原)对于每个血清样本,水平条表示平均OD450指定小鼠株系的读数。
图5
图5。在B6.TLR2中,MA/MBP诱导的肌肉炎症明显减轻−/−.TLR4型−/−双敲除小鼠
A) 显微照片(左栏100倍,右栏400倍)显示从B6.TLR2获得的具有代表性的苏木精和伊红染色的肌肉组织切片−/−.TLR4型−/−(TLR2/TLR4 DKO)和WT C57BL/6小鼠肌肉注射MA/MBP后17天。B) 在n=9 B6.TLR2中观察到的肌肉炎症的平均严重程度评分−/−.TLR4型−/−n=15只C57BL/6小鼠如图所示。C) B6.TLR2免疫MA/MBP的相对IgG抗mHRS抗体滴度−/−.TLR4型−/−(n=9)和C57BL/6(n=15)小鼠被描绘在这个点图中,其中单个数据点代表调整后的OD450使用1:1000血清稀释液和1µg/ml底物抗原浓度获得的值。水平条表示总体平均OD450价值观。
图6
图6。人类HRS的氨基端亚片段通过TLR2和TLR4产生与肌炎诱导相关的可变信号
A) 人HRS(hHRS)亚碎片融合到MBP后,对转染TLR2或TLR4的HEK293细胞产生不同水平的IL-8(pg/ml,y轴)。在0.5µg/ml(TLR4刺激)到3.0µg/ml(TLR2刺激)的浓度范围内使用的蛋白质包括HA2/MBP=氨基酸1–60 hHRS/MBP,HA3/MBP=氨基酸1–90 hHRS/MBP,HA4/MBP=氨基酸1–120小时/MBP,以及HA5/MBP=氨基酸1–151 hHRS/MBP。图表至少代表两个独立的实验。B) 肌肉组织的显微照片(100x)和相应的条形图反映了C57BL/6小鼠肌肉内免疫所引起的肌肉炎症的相对严重程度(HA2,HA3,HA4:n=5只/组;HA5:n=10只小鼠)。误差线代表SEM。C) 用所示氨基末端亚片段对C57BL/6小鼠进行肌内免疫产生的抗人HRS抗体滴度如图所示。单个数据点表示调整后的OD450值(OD450HHR-外径450无抗原),使用1:1000血清稀释液和1µg/ml底物抗原浓度获得。水平条反映平均OD450n=5个样本/免疫原。

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