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。2013年7月3日；5（192）：192ra85。
doi:10.1126/scitranslmed.3006055。

杀菌抗生素诱导哺乳动物细胞线粒体功能障碍和氧化损伤

萨米尔·卡尔加蒂（Sameer Kalghatgi） # 1, 凯瑟琳·斯皮纳 # 1 2 三, 詹姆斯·科斯特洛 1, 马克·利萨 三, J鲁本·莫罗内斯·拉米雷斯 1, 希米恩·斯洛莫维奇 1, 安东尼·莫利纳 三 4, Orian S Shirihai公司 三, 詹姆斯·柯林斯 1 2 三
附属公司

杀菌抗生素诱导哺乳动物细胞线粒体功能障碍和氧化损伤

萨米尔·卡尔加蒂（Sameer Kalghatgi）等。 科学转化医学。 。

摘要

长期的抗生素治疗可能导致患者产生有害的副作用，包括耳毒性、肾毒性和肌腱炎，但抗生素在哺乳动物系统中的作用机制尚不清楚。已有研究表明，杀菌抗生素可诱导细菌中有毒活性氧（ROS）的形成。我们发现，临床相关剂量的杀菌抗生素-喹诺酮类、氨基糖苷类和β-内酰胺类可导致哺乳动物细胞线粒体功能障碍和ROS过度产生。我们证明，这些杀菌抗生素诱导的效应会导致DNA、蛋白质和膜脂的氧化损伤。使用杀菌抗生素治疗的小鼠血液中的氧化应激标记物升高，氧化组织损伤，抗氧化防御机制中关键基因的表达上调，这表明这些抗生素效应具有潜在的生理相关性。通过服用抗氧化剂N-乙酰-l-半胱氨酸或优先使用抑菌抗生素，可以在细胞培养和小鼠体内减轻杀菌抗生素的有害作用。这项工作强调了抗生素在哺乳动物细胞产生氧化组织损伤中的作用，并提出了减轻或预防由此造成的损伤的策略，目的是提高抗生素治疗对人体的安全性。

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数字

图1
图1。杀菌抗生素对哺乳动物细胞造成氧化损伤
与未经处理的细胞相比，使用杀菌剂[环丙沙星（10μg/ml）、氨苄西林（20μg/ml）、卡那霉素（25μg/ml。（A）使用CM-H量化ROS2通过流式细胞仪（左侧为直方图）和微孔板分光光度计（右侧为条形图）检测DCFDA。（B）用线粒体红测定线粒体超氧化物。（C）通过测量Amplex红色荧光定量过氧化氢释放。（D）通过Western blot分析评估抗生素诱导的DNA损伤，以测量磷酸化组蛋白γ-H2AX的丰度，并与作为负荷控制的α-微管蛋白进行比较（条形图中的定量）。（E）此外，通过测量8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）的丰度来评估DNA氧化损伤。（F）使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测氧化蛋白质损伤，即蛋白质羰基化。（G）通过测定丙二醛（MDA）来评估脂质过氧化。所有条形图显示平均值±S.E.M(n个≥ 3). 使用Student’st吨测试(*第页<0.5时**第页< 0.01, ***第页< 0.001).
图2
图2。杀菌抗生素引起线粒体功能障碍
（A）测定了杀菌[环丙沙星（10μg/ml）、氨苄青霉素（20μg/ml）、卡那霉素（25μg/ml）]或抑菌[四环素（10μg/ml）]抗生素对单个分离的ETC蛋白复合物功能的影响。条形图表示与未经处理的复合物相比，经抗生素处理的单个复合物的活性变化。灰色虚线表示几个独立阴性对照的最大抑制（10%）。灰色实线表示IC50阳性对照药物抑制特定靶点复合物。（所有阳性和阴性对照结果见图S7。）（B）使用TMRE和MitoTracker Green对线粒体膜电位进行定量。（C）ATP水平采用荧光素/荧光素酶试验测定。（D）使用比色四氮唑染料（XTT）测量代谢活性。（E）正常（N）和mtDNA-缺失（ρ0)Western blot检测MCF10A细胞，以评估γ-H2AX与负荷对照α-微管蛋白的比值。定量显示在斑点下方。所有条形图显示平均值±S.E.M(n个≥ 3). 使用Student’st吨测试(*第页<0.5时**第页< 0.01, ***第页< 0.001).
图3
图3。杀菌抗生素处理细胞中的线粒体表现出异常、脱落状态
使用TMRE和MitoTracker Green在原代人乳腺上皮细胞中测量线粒体形态。未经处理的样品（左图）显示线粒体形态正常，长而分枝多。环丙沙星处理的细胞（10μg/ml）（右图）线粒体异常短且截短。对未经处理和杀菌抗生素处理的细胞测量了短长径比和圆形与分支形状因子的线粒体百分比。数据为平均值±标准误差(n个≥ 5).
图4
图4。杀菌抗生素降低线粒体基础呼吸和最大呼吸能力
(A类和B)6小时后测量MCF10A细胞的耗氧率（OCR）(A类)和96小时(B)杀菌[环丙沙星（10μg/ml）、氨苄西林（20μg/ml。按照Seahorse OCR方案用抗生素治疗细胞，包括用三种线粒体ETC复合物抑制剂治疗：（i）寡霉素，（ii）FCCP，和（iii）抗霉素A。在（i）之前测得的OCR代表基础呼吸，而在（ii）到（iii）之间测得的OCR代表最大呼吸容量。显示了典型的Seahorse OCR图，条形图为平均值±S.Dn个= 3. 使用Student’st吨测试(***第页< 0.001).
图5
图5。NAC拯救杀菌抗生素引起的氧化损伤在体外
MCF10A细胞在有和没有NAC（10mM）的情况下孵育2小时，然后用环丙沙星（10μg/ml）、氨苄青霉素（20μg/ml）、卡那霉素（25μg/ml）或四环素（10μg/ml）处理6和96小时。（A）用线粒体红测定线粒体超氧化物。（B）使用TMRE和MitoTracker Green定量线粒体膜电位。(C类)使用Seahorse XF24流量分析仪测量OCR，并显示了测试环丙沙星+NAC的代表图。（氨苄西林和卡那霉素见图S10和S11）。(D类)通过8-OHdG定量评估DNA氧化损伤。（E）对蛋白质羰基进行定量以评估蛋白质氧化损伤。（F）通过定量丙二醛（MDA）测定脂质过氧化。数据为平均值±标准误差(n个≥ 3). 使用Student’st吨测试(*第页<0.5时**第页< 0.01, ***第页< 0.001).
图6
图6。杀菌抗生素诱导小鼠氧化损伤
在用环丙沙星（12.5 mg/kg/天）、氨苄西林（28.5 mg/kg/日）或卡那霉素（15 mg/kg/天后）治疗2周或16周的野生型小鼠的血液中测量氧化应激标记物。数据为平均值±标准误差(n个每个治疗组≥3只动物）。使用Student’st吨测试(*第页<0.5时**第页< 0.01).
图7
图7。抗氧化剂可以挽救杀菌抗生素引起的小鼠乳腺组织氧化损伤
在使用杀菌抗生素[环丙沙星（12.5 mg/kg/天）、氨苄西林（28.5 mg/kg/日）、卡那霉素（15 mg/kg/天后）]、添加或不添加NAC（1.5 g/kg/天）或抑菌抗生素[四环素（27 mg/kg/天）]治疗16周后采集小鼠乳腺。环丙沙星需要碱性水（pH 8.0）才能溶解，因此每个地块中的抗生素处理都根据其对照处理进行了分组：碱性H2O（pH=8）用于环丙沙星，H2O代表氨苄西林、卡那霉素和四环素。（A）和B）从处理过的小鼠乳腺组织中检测蛋白质羰基化和脂质过氧化。（C）乳腺组织用抗硝基酪氨酸抗体染色，以测量氧化蛋白损伤（硝化）。蛋白质硝化的定量定义为用抗硝基酪氨酸抗体染色的总组织面积的百分比。数据为平均值±标准误差(n个每个治疗组≥3只动物）。使用Student’st吨测试(*第页<0.5时**第页< 0.01, ***第页< 0.001).（D）（C）中量化的代表性IHC图像。红色箭头表示导管上皮细胞的蛋白质损伤焦点（硝化），黑色箭头表示结缔组织细胞（脂肪细胞和基质细胞）的蛋白质损伤。
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