Identification of PTEN at the ER and MAMs and its regulation of Ca(2+) signaling and apoptosis in a protein phosphatase-dependent manner

doi:10.1038/cdd.2013.77

.2013年12月；20(12):1631-43.

doi:10.1038/cdd.2013.77。 Epub 2013年6月28日。

内质网和巨噬细胞PTEN的鉴定及其对Ca（2+）信号转导和凋亡的蛋白磷酸酶依赖性调控

博诺尼¹, M波诺拉, S马奇, S米西罗利, F波莱蒂, C乔治, P P潘多尔菲, P平顿

附属机构

采购管理信息： 23811847
PMCID公司：下午3284603
内政部： 10.1038/cdd.2013.77

内质网和巨噬细胞PTEN的鉴定及其对Ca（2+）信号转导和凋亡的蛋白磷酸酶依赖性调控

博诺尼等。细胞死亡差异. 2013年12月.

.2013年12月；20(12):1631-43.

doi:10.1038/cdd.2013.77。 Epub 2013年6月28日。

作者

博诺尼¹, M博诺拉, S马奇, S米西罗利, F波莱蒂, C乔治, P P潘多尔菲, P平顿

附属

¹意大利费拉拉大学先进治疗技术实验室炎症跨学科研究中心（ICSI）普通病理科形态学、外科学和实验医学系。

采购管理信息： 23811847
PMCID公司：下午3284603
内政部： 10.1038/cdd.2013.77

摘要

PTEN（10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）的抑癌活性被认为主要归因于其脂质磷酸酶活性。PTEN使脂质第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸去磷酸化，直接拮抗磷脂酰肌苷3-激酶-Akt途径，阻止Akt的活化磷酸化。PTEN还具有其他拟议的作用机制，包括特征不明确的蛋白磷酸酶活性、蛋白与蛋白质的相互作用，以及在细胞核和线粒体等不同细胞隔室中出现的功能。我们在这里显示，一部分PTEN蛋白定位于内质网（ER）线粒体相关膜（MAM）、钙（2+）从内质网向线粒体转移的信号域和凋亡诱导。我们证明PTEN沉默会损害ER Ca（2+）的释放，降低细胞溶质和线粒体Ca（2+）瞬态，并降低细胞对Ca（2+）介导的凋亡刺激的敏感性。PTEN对内质网的特异性靶向足以增强内质网对线粒体Ca（2+）的转移和对凋亡的敏感性。在钙依赖性凋亡诱导过程中，内质网PTEN定位进一步增加。重要的是，PTEN与肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3Rs）相互作用，这与它们的磷酸化减少和Ca（2+）释放增加有关。我们认为ER-localized PTEN以蛋白磷酸酶依赖性的方式调节内质网Ca（2+）的释放，从而抵消Akt介导的通过IP3Rs减少Ca（2+）释放。这些发现为PTEN抑瘤作用的机制和范围提供了新的见解，突出了治疗干预的新潜在策略。

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数字

图1
PTEN的亚细胞定位。(一)转染mtDsRED（线粒体，红色）的HEK-293细胞进行PTEN（绿色）、PDI（ER，蓝色）免疫染色，并负载Hoechst（细胞核，青色）。下面的合并图像显示了以下四个通道之间的一系列重叠信号：PTEN和Hoechst、PTEN和mtDsRED、PTEN与PDI。比例尺，10 μm.插图显示放大的图像。(b条)western blot（WB）分析揭示了HEK-293细胞亚细胞组分的蛋白质组分。使用特异性单克隆抗体显示PTEN的存在。所有馏分中也证实了Akt的存在。标记蛋白表明线粒体（电压依赖性阴离子通道，VDAC）、ER（IP3R3）、MAM（Sigma-1R）、胞浆(β-微管蛋白）和细胞核（层粘连蛋白B1）（排除核污染）。所有标记均在各自的隔间中富集。在MAM中ER和线粒体膜之间的紧密结合解释了VDAC和IP3R3在这些微域中的存在。H：匀浆；Mc：粗线粒体；Mp：纯线粒体；呃；MAM；C：胞浆。(**c（c）**)HEK-293细胞进行亚细胞分离。Mc部分进一步用PK处理，PK只能消化那些不受封闭磷脂双层保护的蛋白质。己糖激酶I（HK-I）用作消化对照。观察到HK-I的PK消化显著，但VDAC没有。用所示抗体对不同组分进行免疫印迹

图2
PTEN沉默对细胞内钙的影响²⁺平衡。(一)模拟（对照）或siRNAs-PTEN-（siPTEN）转染细胞HEK-293裂解物的Western blot，检测PTEN，pAkt^Ser473系列总Akt和肌动蛋白作为负荷控制。(b条)ER钙²⁺平衡。(b条i） [加利福尼亚州²⁺]_呃稳态水平（321.1±27.30 μM代表控制n个=10; 286.7±23.17 μM代表siRNA-PTEN（1049）n个=12; 293.9±27.59 μM代表siRNA-PTEN（219）n个=10）；(b条ii）ER Ca的修改²⁺PTEN沉默后的释放动力学；(b条iii）ER Ca的平均比率²⁺释放（Vmax:28.68±2.12 μM/s用于控制n个=10; 21.89±1.97 μsiRNA-PTEN的M/s（1049）n个=12,*P（P）*<0.05; 21.25±2.69 μsiRNA PTEN的M/s（219）n个=10,*P（P）*<0.05). 代表性痕迹(**c（c）**i） [加利福尼亚州²⁺]_c（c）（峰值：1.29±0.04 μM代表控制n个=31; 1.15±0.04 μM代表siRNA-PTEN（1049）n个＝34，*P（P）*<0.05; 1.16±0.03 μM代表siRNA-PTEN（219）n个=34,*P（P）*<0.05）和(d日i）线粒体钙²⁺瞬态（[Ca²⁺]_米峰值：2.43±0.15 μM代表控制n个=14; 1.94±0.12 μM代表siRNA-PTEN（1049）n个=12,*P（P）*<0.05; 1.97±0.10 μM代表siRNA-PTEN（219）n个=13,*P（P）*<0.05). [Ca的百分比²⁺]_c（c）(c–ii）和[Ca²⁺]_米(d日ii）峰值归一化为对照组的平均值。平均值±S。变化的E.M.以百分比表示。细胞被转染，[Ca²⁺]按照材料和方法进行测量。如有指示，细胞受到100 μM ATP诱导Ca²⁺从ER中释放。痕迹和条形图代表来自至少三个产生类似结果的独立实验的≥10个样本**P（P）*<0.05

图3
PTEN的亚细胞靶向性对线粒体钙的影响²⁺吸收。(一)重组野生型PTEN和靶向PTEN嵌合体在联合转染mtDsRED（线粒体，红色）的HEK-293细胞中的定位。对细胞进行PTEN（绿色）、PDI（ER，蓝色）免疫染色，并加载Hoechst（细胞核，蓝色）。合并图像显示四个通道之间的重叠（白色），放大区域如下。比例尺，10 μ米(b条)模拟转染细胞（对照）或过度表达PTEN的细胞和靶向PTEN嵌合体的HEK-293裂解产物的Western blot检测PTEN、pAkt^Ser473系列，总Akt和肌动蛋白。(**c（c）**)pAkt的WB分析^Ser473系列以及用重组野生型PTEN或ER-PTEN转染的HEK-293细胞的过氧纯化亚细胞部分的总Akt水平。未转染细胞匀浆（ctrl）被用作生理条件下Akt丰度和磷酸化水平的指标。(d日)线粒体钙²⁺与对照细胞相比，PTEN、强迫核（NLS）、细胞质（NES）、质膜（snap25）、OMM（AKAP）或ER嵌合体过度表达（黑色）后的稳态调节（灰色）；在有指示的地方，细胞被挑战100个 μM ATP诱导Ca²⁺从ER中释放(**e（电子）**)[Ca的百分比²⁺]_米峰值归一化为对照组的平均值。平均值±S。变化的E.M.以百分比表示。痕迹和柱状图代表至少三个独立实验中产生的10个以上样本，这些实验产生了类似的结果**P（P）*<0.05

图4
PTEN沉默、过度表达或靶向内质网外表面对细胞内钙的影响²⁺ArA诱导的动员和凋亡反应。(一和b条)细胞负载钙²⁺使用同一样品中的指示剂Fura-2/AM和未转染的细胞来比较340/380的变化纳米比。(一)细胞质钙²⁺增加80 μPTEN沉默细胞中的M ArA，代表性迹线（i）和条形图（平均值±S.E.M.）（ii）显示细胞溶质Ca百分比的变化²⁺增加标准化为∑（F₃₄₀/F类₃₈₀)与未转染细胞相比（对照组Δ%：−16.6±11.0n个=58个电池；−siRNA PTEN为47.4±9.5（1049）n个=55个单元格，*P（P）*<0.05; −对于siRNA-PTEN（219），为44.8±6.1n个=59个单元格，*P（P）*<0.05). (b条)细胞质钙²⁺增加80 μ过度表达PTEN或ER-PTEN的细胞中的M ArA，代表性迹线（i）和条形图（平均值±S.E.M.）（ii）显示细胞溶质Ca百分比的变化²⁺增加标准化为∑（F₃₄₀/如果₃₈₀)与未转染细胞相比（对照组Δ%：−2.8±8.8n个=25个单元格；PTEN为3.1±2.0n个=24个单元；ER-PTEN为29.8±10.0n个=36个单元格，*P（P）*<0.05). (**c（c）**)用siPTEN（1049）、PTEN、ER-PTEN转染HEK-293细胞或进行模拟转染（对照）。36岁转染后h，用80 μM ArA或车辆（EtOH）60 min，然后使用基于洋地黄素的亚细胞分离技术纯化细胞溶质组分，并用WB分析细胞溶质细胞色素的检测*c（c）*。作为加载控制，β-微管蛋白用于细胞溶质部分，而线粒体蛋白VDAC的存在被评估为部分纯度的指标。报告了具有代表性的结果。数字表示密度测定的细胞色素*c（c）*相对于的级别β-微管蛋白。(d日)HEK-293细胞转染为(**c（c）**)接受80次治疗 μM ArA或车辆120 分钟，然后制备总细胞裂解物并通过WB分析以比较裂解的胱天蛋白酶-3（17 kDa）水平。结果来自一个单独的实验，该实验代表了四个独立的实验。(**e（电子）**)荧光标记物和siPTEN（1049）、PTEN或ER-PTEN共同转染的细胞对凋亡的敏感性。用80治疗后 μM ArA或车辆120 min，比较转染细胞和未转染细胞的存活率。在这些实验中，模拟转染细胞和PTEN过度表达细胞在ArA处理后的荧光细胞百分比没有差异（Δ%分别为−2.5±4.6和−7.1±3.2）；因此，它们对凋亡刺激的敏感性相同，死亡程度相同。在相同的条件下，观察到PTEN沉默细胞的表观转染效率增加（Δ%38.5±9.4），表明对凋亡刺激的敏感性降低，而ER PTEN过表达荧光细胞的百分比降低（Δ%-17.6±2.7）反映出对凋亡挑战的敏感性更高**P（P）*<0.05

图5
钙²⁺-依赖性凋亡诱导增加PTEN对内质网的定位及其与IP3R3的相互作用。(d日)GFP-PTEN（左面板）或GFP（右面板）与ER-RFP之间的结肠化，在用80 μM ArA用于90 最小。合并图像中的黄色信号表示绿色和红色荧光（i）之间的重叠空间关系。下图显示了ArA处理后，沿穿过GFP-PTEN和ER-RFP（ii）或GFP和ER-RFF（iii）细胞的像素线（显微照片中的粗白线）测量的归一化荧光强度分布。条形图显示了使用Manders的像素强度空间相关方法对（i）中表示的数据的每个通道与其他通道重叠的比例。Manders的重叠系数报告为平均值±S。三个独立实验的E.M。(b条)PTEN，pAkt的免疫印迹^Ser473系列以及用80 μM ArA或车辆（EtOH）60 最小值表示相对于Akt和PTEN对应部分标记或pAkt标准化Akt标记的密度测定蛋白质水平^Ser473系列. (**c（c）**)ER组分的制备方法(b条)用于内源性IP3R3与PTEN和Akt的联合免疫沉淀。以IP3R3为诱饵，在相同分子量的IP3R4（～250 kDa），假设它代表IP3R3的磷酸化状态。在相同的斑点中pAkt的水平^Ser473系列如图所示**P（P）*<0.001

图6
ER钙²⁺动员和凋亡反应受到PTEN脂质和蛋白磷酸酶活性的不同调节。(一)PTEN表达和Akt磷酸化通过转染ER-PTEN-、ER-PTEN（C124S）-或ER-PTEN-G129E编码质粒的HEK-293裂解产物的WB进行验证。(b条)线粒体钙的代表性痕迹²⁺瞬态（i）。[Ca的百分比²⁺]_米峰值归一化为对照组的平均值（图3e）（ii）。(**c（c）**)细胞质钙²⁺由80引起的响应 μM ArA表示为340/380的荧光比率纳米（i）。细胞溶质钙百分比的变化²⁺增加标准化为∑（F₃₄₀/F类₃₈₀)与未转染细胞相比，随着时间的推移（ii）（对于ER-PTEN，Δ%:29.8±10.0；对于ER-PTEM（C124S），Δ%-29.4±4.7），*P（P）*<0.001; ER-PTEN（G129E）为45.1±24.1。(d日)用编码ER-PTEN（C124S）或ER-PTEN（G129E）的质粒转染HEK-293细胞。ArA处理后，细胞溶质组分被纯化并用WB分析以检测细胞溶质细胞色素*c（c）*.β-Tubulin被用作负载控制，VDAC被评估为馏分纯度的指标。报告了具有代表性的结果。数字表示密度测定的细胞色素*c（c）*相对于的级别β-微管蛋白。(**e（电子）**)HEK-293细胞转染为(一)接受80次治疗 μM ArA或车辆120 min，然后制备总细胞裂解物并用WB分析，以比较裂解的caspase-3水平。结果来自代表三个独立实验的单个实验。(**（f）**)荧光标记物和编码ER-PTEN、ER-PTER（C124S）或ER-PTEN（G129E）的质粒共同转染的细胞对凋亡的敏感性。条形图显示了ArA处理后存活细胞群中荧光细胞百分比的变化**P（P）*<0.05. (克)内源性IP3R3、Akt和ER-PTEN（C124S）或ER-PTEN（G129E）的共免疫沉淀。在相同的印迹中，p-IP3R3和pAkt的水平^Ser473系列如图所示**P（P）*<0.05

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