Identification and Validation of a Putative Polycomb Responsive Element in the Human Genome

doi:10.1371/journal.pone.0067217

.2013年6月21日；8（6）：e67217。

doi:10.1371/journal.pone.0067217。 2013年印刷。

人类基因组中一个假定的多梳响应元件的鉴定与验证

赫曼特·本加尼¹, 什维塔·门迪拉塔, 贾扬特·梅尼, 达萨里·瓦桑蒂, 希纳苏丹, 莫森·加西米, 茉莉花Ahluwalia, Sowmya Ramachandran公司, 拉克什·K·米什拉, 瓦尼·布拉马查里

附属公司

PMID： 23805300
预防性维修识别码：项目经理3689693
内政部： 10.1371/journal.pone.0067217

人类基因组中一个假定的多梳响应元件的鉴定与验证

赫曼特·本加尼等。公共科学图书馆一号. 2013.

.2013年6月21日；8（6）：e67217。

doi:10.1371/journal.pone.0067217。 2013年印刷。

作者

赫曼特·本加尼¹, 什维塔·门迪拉塔, Jayant Maini公司, 达萨里·瓦桑蒂, 希纳苏丹, 莫森·加西米, Jasmine Ahluwalia茉莉花, Sowmya Ramachandran公司, 拉克什·K·米什拉, 瓦尼·布拉马查里

附属

¹B.R.Ambedkar博士，印度德里大学生物医学研究中心。

PMID： 23805300
预防性维修识别码：项目经理3689693
内政部： 10.1371/journal.pone.0067217

摘要

后生动物的表观遗传细胞记忆机制涉及多梳和三疣类蛋白质。然而，在哺乳动物中，与这些蛋白质相互作用的顺式元件却知之甚少。在定向搜索中，我们发现了一个潜在的多梳反应元件，该元件具有25个重复的YY1结合基序，我们将其命名为PRE-PIK3C2B，因为它出现在人类PIK3C2基因的第一个内含子中。它下调HEK细胞中报告基因的表达，这种抑制依赖于多梳组蛋白（PcG）。我们证明PRE-PIK3C2B在体外直接与YY1相互作用，并在体内招募PRC2复合物。敲除YY1或SUZ12后，HEK细胞中PcG蛋白（包括YY1到PRE-PIK3C2B）的定位降低。内源性PRE-PIK3C2B显示抑制状态和活性状态的二价标记分别为H3K27me3和H3K4me3。在转基因果蝇中，PRE-PIK3C2B下调了微白表达，表现出杂色和配对敏感沉默（PSS），这在哺乳动物PRE中以前没有证明。总之，我们的结果强烈表明，PRE-PIK3C2B是多梳蛋白相互作用的位点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。PRE-PIK3C2B对转录的影响。**
A.转染分析中使用的部分载体：CMV代表启动子，GFP是所有构建物中的报告者。pcDNA3.1-GFP为不含PRE-PIK3C2B的对照质粒，pc（1 kb）UP为pPRE-PIKC2B/UP-GFP，pc（1kb）DN为pPRE-PIK3C2A/DN-GFP，分别克隆于报告子上游和下游。B.GFP表达表示为与pcDNA3.1GFP表达的比率。pc（25mer）11UP和pc（25-mer）11DN是分别对应于GFP报告子上游和下游克隆的PRE-PIK3C2B重复单元的25mer寡核苷酸。pcΔYY1UP和pcΔYY1DN是GFP报告子上游和下游分别克隆的无YY1基序的重复单元。显示了三份分析的误差条S.E.M。（**）p值<0.005，n = 3

**图2。YY1与PRE-PIK3C2B的定向交互。**
标记的25 merOligo对应于PRE-PIK3C2B（5′AGTGAA）的重复单元GCCAT公司GTGAGAATACC3′）作为探针，用纯化的His-YY1进行凝胶迁移率转移测定。冷探针1是无YY1识别序列（5′AGTGAAGTGAGAATACC3′）的竞争性无标记同源物（Oligo25 mer），2-（OligoΔYY1）重复单位。每个竞争寡聚物的浓度都比标记探针高100倍。带有防YY1的超级换档显示在最后一条车道上（箭头）。

**图3。HEK细胞中PcG蛋白与PRE-PIK3C2B的相互作用。**
实验在HEK293细胞中进行。A-内源性PRE-PIK3C2B区域的示意图，带有PCR所用的引物（箭头）和25 mer重复单元（填充框）。显示有抗体的B和C-ChIP。输入20%的超声染色质。对照细胞和转染siRNAYY1和siRNA SUZ12的细胞中ChIP后PRE-PIK3C2B的D-定量PCR。在没有和存在YY1siRNA的情况下，通过qPCR估计EZH2与PRE-PIK3C2B的E-相互作用：在没有或存在siRNAYY1的情况下EED和H3K4me3在PRE-PIK1C2B的定位。误差线：三份分析的S.E.M，*p<0.05，**p值<0.005，n = 3.阳性和阴性对照的qPCR曲线如图S3和S4所示。

**图4。PRE-PIK3C2B对YY1和SUZ12依赖性转录抑制。**
A-内源性表达*PIK3C2B型*用qPCR分析HEK细胞。siRNAYY1和siRNASUZ12存在时表达增加。以未转染的HEK细胞中的表达为对照。B-对报告基因表达的影响。向量的命名与图1中的相同。与siRNA YY1和siRNA SUZ12共转染前后，pcDNA-GFP、pc（1 kb）UP或pc（1 kb）DN中GFP表达的比率显示在Y轴上。误差条，三份分析的S.E.M显示*p值<0.05，**p值<0.005，n = 三。

**图5。miniwhite表达的配对敏感沉默（PSS）。**
图中显示了PI-17系转基因果蝇中因微白色表达而导致的眼睛色素沉着。I-P/+和P/P，杂合和纯合转基因系，纯合果蝇表现出PSS；II-ΔP/+和ΔP/ΔP是转基因果蝇，PRE-PIK3C2B通过与Cre果蝇杂交而被翻转。如图所示，帧a-d显示了在不同遗传背景下对PSS的挽救。框a中的箭头表示纯合果蝇的PSS，框c和框d中的箭头标记PSS的拯救。

**图6。转基因果蝇中PRE-PIK3C2B与PRC基因的遗传互作。**
不同PcG突变背景下的PRE-PIK3C2B对拯救眼部色素沉着的作用显示：拯救眼部色素的案例用箭头标记；反式杂合子显示出更好的眼部色素沉着恢复。我们在所有情况下都使用了相同的图像处理条件。

**图7。Pho突变对PRE-PIK3C2B介导的抑制的影响。**
A-通过qPCR表达miniwhite mRNA。遗传背景如直方图所示。*p<0.05，**p<0.005。B-PHO突变和未突变转基因果蝇眼睛色素沉着的比较。ΔPI表示PRE-PIK3C2B翻转的线。

**图8。转基因果蝇中PRE-PIK3C2B与Trx基因的遗传互作。**
不同TrxG突变背景下的PRE-PIK3C2B对眼睛颜色的影响显示：单突变zeste（A）、brm（B）和双突变zester和brm（C）。左侧面板显示了PRE-PIK3C2B的转基因果蝇杂合，右侧面板显示的是删除了PRE-PI K3C2b的类似背景转基因果蝇。我们在所有情况下都使用了相同的图像处理条件。

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[1] Cavalli G，Paro R（1998）果蝇Fab-7染色体元件在有丝分裂和减数分裂期间传递表观遗传。牢房93:505–18。-公共医学

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[5] Simon JA，Kingston RE（2009）多梳基因沉默的机制：已知和未知。Nat Rev Mol Cell沸腾10:697–708。-公共医学

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[8] Cao R，Wang L，Wang H，Xia L，Erdjument-Bromage H，et al.（2002）组蛋白H3赖氨酸27甲基化在多梳群沉默中的作用。科学298:1039-43。-公共医学

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[10] Nakamura T，Mori T，Tada S，Krajewski W，Rozovskaia T，et al.（2002）ALL-1是一种组蛋白甲基转移酶，组装参与转录调控的蛋白质超复合物。分子细胞10:1119–28。-公共医学

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