Roles of p53 in herpes simplex virus 1 replication

doi:10.1128/JVI.01581-13

.2013年8月；87(16):9323-32.

doi:10.1128/JVI.01581-13。 Epub 2013年6月19日。

p53在单纯疱疹病毒1复制中的作用

丸祖鲁裕平¹, 藤井裕久, Masaaki Oyama公司, Hiroko Kozuka-数据, 加藤秋久, 川口安史

附属公司

PMID： 23785201
预防性维修识别码：下午1754062
内政部： 10.1128/JVI.01581-13

p53在单纯疱疹病毒1复制中的作用

于海·马鲁祖鲁（Yuhei Maruzuru）等。 J维罗尔. 2013年8月.

.2013年8月；87(16):9323-32.

doi:10.1128/JVI.01581-13。 Epub 2013年6月19日。

作者

于海·马鲁祖鲁（Yuhei Maruzuru）¹, 藤井裕久, Masaaki Oyama公司, Hiroko Kozuka-数据, 加藤秋久, 川口安史

附属

¹日本东京大学医学研究所微生物与免疫学系分子病毒学分部。

PMID： 23785201
预防性维修识别码：项目经理3754062
内政部： 10.1128/JVI.01581-13

摘要

p53通过其调节各种细胞途径的能力，在细胞对各种应激因素的反应中是一个关键因素。在本研究中，瞬时表达的单纯疱疹病毒1（HSV-1）调节蛋白ICP22的串联亲和纯化与基于质谱的蛋白质组学技术相结合，随后的分析表明ICP22与HSV-1感染细胞中的p53相互作用。在p53（-/-）细胞中，与亲代p53（+/+）细胞相比，野生型HSV-1的复制减少，表明p53对HSV-1复制有积极影响。相反，ICP22-null突变病毒在p53（-/-）和p53（+/+）细胞中的病毒复制水平相似。感染后2小时，在感染野生型HSV-1或ICP22-null突变病毒的p53（-/-）细胞中，一种重要的病毒调节蛋白ICP27的表达水平低于p53（+/+）细胞。相比之下，感染后18小时，感染ICP22-null突变病毒的p53（-/-）细胞中的关键病毒调节蛋白ICP0的表达水平高于p53（+/+）细胞，尽管感染野生型HSV-1的p53细胞和p53细胞中的ICP0表达水平几乎相同。这些结果表明，p53总体上促进了HSV-1的复制，p53在HSV-1复制中起到了积极和消极的作用：在感染早期上调ICP27的表达，在感染后期下调ICP0的表达，而ICP22对此有拮抗作用。

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数字

图1
（A）编码用MEF标记的ICP22的表达质粒pcDNA-MEF-ICP22的示意图。（B）将用于A组的质粒pcDNA-MEF-ICP22转染293T细胞，收获细胞，并用抗Myc和抗Flag抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物在变性凝胶中分离并银染。箭头标记MEF-ICP22。分子质量标记显示在右侧。

图2
野生型病毒YK304的基因组结构示意图以及本研究中重组病毒的相关域。第1行，YK304基因组在UL3和UL4之间基因间区域的线性表达，带有bacmid（BAC）；第2行，编码病毒复制起源S（Ori-S）和Us1和Us2开放阅读框的结构域；第3行，ICP22和Us1.5的域；第4行至第6行，本研究中重组病毒的示意图。

图3
为本研究构建的重组病毒的特征。（A）用ICP22、Flag表位、ICP0、ICP27或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析，分析在MOI为5时模拟感染或感染野生型HSV-1F、YK421（ΔICP22）、YK42.2（Δ电感耦合等离子体22-修复）或YK423（MEF-ICP22）18 h的HEL细胞。HEL（B）和Vero（C）细胞在MOI为5时感染HSV-1F、YK421（ΔICP22）、YK42.2（Δ电感耦合等离子体22-修复）或YK423（MEF-ICP22）。在指定的时间收获来自细胞培养上清液和感染细胞的总病毒，并在Vero细胞上进行分析。

图4
ICP22与p53的相互作用。（A）采集MOI为5时感染野生型HSV-1F（1区）或YK423（MEF-ICP22）（2区）的HEL细胞，用抗标记抗体（α-Flag）进行免疫沉淀（IP），并用抗p53抗体（α-p53）或抗标记抗体进行免疫印迹（IB）分析。WCE，全细胞提取物。（B）采集MOI为5时感染野生型HSV-1F（1区）或YK711（MEF-gB）（2区）的HEL细胞，用抗标记抗体（α-Flag）免疫沉淀（IP），并用抗p53抗体（α-p53）、抗层粘连蛋白B1（α-laminB1）或抗标记抗体免疫印迹（IB）进行分析。WCE，全细胞提取物。（C）在MOI为10时，感染YK423（MEF-ICP22）或野生型HSV-1F的HEL细胞被固定、渗透，并用抗Flag和抗p53抗体染色，然后用共焦显微镜检查。上中柱和下柱分别显示蛋白质荧光和同时采集蛋白质荧光和数字干扰对比度。

图5
p53-null突变对野生型HSV-1F、YK421（ΔICP22）和YK422（ΔCP22-修复）生长的影响。HCT116 p53型^+/+和HCT116 p53^−/−细胞以0.01的MOI感染野生型HSV-1F、YK421（ΔICP22）或YK422（Δ电感耦合等离子体22-修复）。在指定的时间从细胞培养上清液和感染细胞中采集总病毒，并在Vero细胞上进行分析。

图6
p53重新引入HCT116 p53的作用^−/−细胞对病毒复制的影响。（A） HCT116 p53型^+/+-空，HCT116 p53^−/−-空，HCT116 p53^−/−第53页⁺用p53或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。（B） HCT116 p53型^+/+-空，HCT116 p53^−/−-空，HCT116 p53^−/−第53页⁺用野生型HSV-1F、YK421（ΔICP22）或YK422（ΔICP22修复）以0.01的MOI感染细胞。在感染后48小时从细胞培养上清液和感染细胞中获取总病毒，并在Vero细胞上进行分析。*P（P）*值由双尾学生计算t吨测试。

图7
p53-null突变对感染细胞中ICP27蛋白表达的影响。（A） HCT116 p53型^+/+和HCT116 p53^−/−在指定时间采集MOI为5时感染野生型HSV-1F或YK421（ΔICP22）的细胞，用ICP27或α-微管蛋白抗体免疫印迹法分析ICP27和α-微管蛋白的数量。ICP27在感染后2小时的暴露时间更长。（B） HCT116 p53^+/+和HCT116 p53^−/−在指定时间采集MOI为5时感染野生型HSV-1F的细胞，并用ICP22和α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析ICP22和β-微管蛋白质的数量。（C） HCT116 p53型^+/+-空，HCT116 p53^−/−-空，HCT116 p53^−/−第53页⁺收集感染HSV-1F的细胞，以5倍的MOI感染2小时，并用ICP27和α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。

图8
p53-null突变对感染细胞中ICP27 mRNA表达的影响。HCT116 p53型^+/+和HCT116 p53^−/−在指定时间采集MOI为5时感染野生型HSV-1F的细胞，并通过定量RT-PCR分析ICP27 mRNA的数量。每个条形图是三个独立实验数据的平均值±标准误差。HCT116 p53的平均值^−/−计算的细胞数与HCT116 p53的细胞数有关^+/+细胞，归一化为1。*P（P）*值由双尾学生计算t吨测试。

图9
p53本身或p53与VP16结合对ICP27启动子的影响。HCT116 p53型^−/−用pRL-CMV和pICP27-luc（ICP27启动子）（A）或pSRα-luc（SRα启动子）（B）与pcDNA5/FRT（空）、pcDNA-VP16（VP16）和/或pcDNA-p53（p53）组合转染细胞。转染后24小时，检测荧光素酶活性。相对启动子活性计算为萤火虫荧光素酶活性/Renilla荧光素酶活性。结果是三次重复实验结果的平均值±标准误差。数据是三个独立实验的代表。*P（P）*值由双尾学生计算t吨测试。

**图10**
p53-null突变对ICP0基因表达的影响。（A） HCT116 p53型^+/+和HCT116 p53^−/−采集在MOI为5时感染野生型HSV-1F、YK421（ΔICP22）或YK422（Δ电感耦合等离子体22-修复）18小时的细胞，并用ICP0、ICP27或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析ICP0、电感耦合等离子体27和α-微管蛋白的表达。（B） HCT116 p53型^+/+-空，HCT116 p53^−/−-空的和HCT116 p53^−/−第53页⁺收集感染YK421（ΔICP22）的细胞，以5倍的MOI感染18小时，并用ICP0或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。（C） HCT116 p53型^+/+和HCT116 p53^−/−采集MOI为5时感染YK421（ΔICP22）18 h的细胞，用定量RT-PCR分析ICP0 mRNA。每个条形图是三个独立实验数据的平均值±标准误差。HCT116 p53的平均值^−/−计算的细胞数与HCT116 p53的细胞数有关^+/+细胞，归一化为1。这个*P（P）*值由双尾学生计算t吨测试。（D） HCT116 p53型^+/+和HCT116 p53^−/−在MOI为5时感染野生型HSV-1F、YK421（ΔICP22）或YK422（Δ电感耦合等离子体22-修复）的细胞在感染后4小时用20μM MG132或DMSO处理，在MG132和DMSO的存在下再感染14小时。然后收集感染细胞，并用ICP0或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。

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