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.2013年8月16日;288(33):24091-103.
doi:10.1074/jbc。M112.444505。 Epub 2013年6月14日。

受体激活时G蛋白信号激活剂3向高尔基体的转运及其对转高尔基网络的影响

附属公司

受体激活时G蛋白信号激活剂3向高尔基体的转运及其对转高尔基网络的影响

Sukru S Oner公司等。 生物化学杂志. .

摘要

G蛋白信号转导的II类激活剂通过G蛋白调节(GPR)基序与Gαi、Gαt和Gαo相互作用,发挥不同的功能作用,该基序是Gα-GDP的对接位点。我们最近报道了细胞表面七跨膜受体对AGS3-Gαi信号模块的调节。在受体激活后,AGS3可逆地从细胞皮层分离,这表明它可能作为一个信号转导器发挥下游信号的作用,这一问题在本报告中得到了解决。在表达α2A/D-AR和Gαi3的HEK-293和COS-7细胞中,受体激活导致内源性AGS3和AGS3-GFP从细胞皮层转移到近核区,在那里与高尔基体(GA)标记物共同定位。激动剂诱导的AGS3易位被α2-AR拮抗剂rauwolscine逆转。AGS3的TPR结构域是激动剂诱导AGS3从细胞皮层向GA移位所必需的,而这种移位被百日咳毒素预处理或磷脂酶Cβ抑制剂U73122阻断。激动剂诱导的AGS3向GA的易位改变了转高尔基网络的功能组织和蛋白质分类。AGS3在细胞皮层和GA之间的调节运动为调节转高尔基网的蛋白质分泌和/或内体再循环事件提供了意想不到的机制。

关键词:AGS3-Gαi复合物;G蛋白信号转导激活因子3;G蛋白偶联受体(GPCR);G蛋白;GPR主题;高尔基;分泌途径;信号转导;贩运;trans-Golgi网络。

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数字

图1。
图1。
细胞表面受体活化对AGS3与Gα相互作用的影响i1号机组AGS3的亚细胞分布。 一个,AGS3-Rluc和Gα之间的实时BRETi1号机组-YFP公司。表达phRluc::AGS3(10 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i1号机组-YFP(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-按照“实验程序”所述,处理AR(750 ng)用于BRET测量。α2安培/天-AR激动剂UK-14304和拮抗剂罗沃辛(劳乌)如图所示添加。这些数据表示为平均值±S.E(误差线) (n个= 3).B类,细胞转染AGS3-GFP(25 ng),pcDNA3::Gαi3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng),与载体或UK-14304(10μ)10分钟,然后按照“实验程序”中的描述进行免疫荧光图像分析。呈现的图像(10×物镜)代表了“试验程序”中描述的多次实验
图2。
图2。
细胞表面受体激活对AGS3亚细胞分布的影响。HEK-293型(一个)或COS-7(B类)表达pEGFP::AGS3(25 ng-HEK,100 ng-COS-7),pcDNA3::Gα的细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或UK-14304(10μ)10分钟,并进行荧光显微镜检查。高尔基标记GM130(红色)如“实验程序”所述,通过免疫荧光检测。所示图像代表了10个(HEK)或三个(COS-7)单独的实验。这个箭头表明AGS3在受体激活后的近距离定位。酒吧,10微米。底部面板,通过荧光强度扫描定量AGS3-GFP和GM130的相对亚细胞分布(绿色,AGS3-GFP;红色,GM130)通过电池,如线如“实验程序”所述
图3。
图3。
细胞表面受体激活对AGS3和GA标记蛋白TGN46和甘露糖苷酶II亚细胞分布的影响。转染pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或UK-14304(10μ)10分钟后进行荧光显微镜检查。高尔基标记TGN46(反式-高尔基网络)(一个)和Mann-II(管腔GA)(B类)如“实验程序”所述,通过免疫荧光检测。显示的图像代表了5-10个单独的实验。酒吧,10微米。通过荧光强度扫描定量AGS3-GFP、TGN46和Mann-II的相对亚细胞分布(绿色,AGS3-GFP;红色,GM130)通过电池,如线如“实验程序”所述
图4。
图4。
AGS3易位的定量分析。表达pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或UK-14304(10μ)10分钟,并进行荧光显微镜检查。一个,与激动剂UK-14304孵育的细胞的代表性图像,说明了两个细胞群体的反应。这个白色箭头表明在激动剂治疗后,细胞表现出AGS3-GFP的强健、近圆形定位,这在视觉上是明显的。这个红色箭头表明AGS3-GFP在细胞内分布更为分散。B类,使用Fiji图像处理套件进行定量共定位分析,以生成载体和与激动剂UK-14304孵育的细胞的阈值Pearson相关系数,如“实验程序”所述。激动剂孵育后鉴定了两个一般的细胞亚群,并评估每个群体AGS3-GFP和GA标记蛋白的共定位。这个白色条对应于激动剂治疗后AGS3表现出强健、相邻定位的细胞亚群。这个红色条对应于“实验程序”中描述的第二个细胞亚群C类,通过目视检查AGS3和GA标记蛋白之间的光谱重叠来确定激动剂诱导的AGS3-GFP向高尔基体的移位,如“实验程序”所述(n个= 3). 数据表示为平均值±S.E(误差线)如“实验程序”*所述,第页< 0.0001车辆编号,第页< 0.0001. 这个以上数字这个酒吧在里面圆括号表示检查的AGS3-GFP表达细胞的数量。
图5。
图5。
受体激活后AGS3和早期内体或溶酶体标记物的亚细胞分布比较。表达pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或UK-14304(10μ)10分钟,按照“实验程序”进行荧光显微镜检查。早期内体标记EEA1(一个)和溶酶体标记LAMP2(B类)如“实验程序”所述,通过免疫荧光检测。显示的图像代表了三个单独的实验。通过荧光强度扫描定量AGS3-GFP、EEA1和LAMP2的相对亚细胞分布(绿色,AGS3-GFP;红色,EEA1或LAMP2)通过电池线如“实验程序”所述
图6。
图6。
AGS3向高尔基体移位的时间进程和机制。 一个,HEK-293细胞表达pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gαi3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与UK-14304(1μ)用于不同时间段,并进行荧光显微镜处理。所示图像代表了三个单独的实验。这个箭头表明受体激活后AGS3的近核区定位。红色,GM130。底部,AGS3-GFP和GM130的相对亚细胞分布通过细胞荧光强度扫描(绿色,AGS3-GFP;红色,GM130)进行量化,如线如“实验程序”所述B类左边,激动剂诱导AGS3-GFP向高尔基体的易位,通过与GM130共定位测定。通过添加拮抗剂rauwolscine来评估UK-14304诱导的AGS3易位的可逆性(劳乌) (10 μ)将细胞与UK-14304(1μ). Rauwolscine孵育持续10分钟,然后按照“实验程序”所述对细胞进行荧光显微镜处理。另一组细胞在与激动剂孵育之前,用载体或100 ng/ml百日咳毒素处理16小时。数据表示为平均值±S.E(误差线) (n个= 3–7).中部,磷脂酶C抑制剂U73122对AGS3与GM130共定位测定的激动剂诱导的高尔基体易位的影响。表达pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)用U73122(10μ)或非活动模拟U73343(10μ)添加α之前保持20分钟2安培/天-AR激动剂UK-14304。在处理细胞进行图像分析之前,用激动剂孵育10分钟。数据表示为平均值±S.E(n个= 3).赖特,对AGS3-GFP与GM130共定位的细胞进行定量分析。表达pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或brefeldin A孵育(博鳌亚洲论坛)(10μg/ml)30分钟,激动剂(UK-14304,1μ)然后加入,继续培养10分钟。GM130(红色)免疫荧光检测。数据表示为平均值±S.E(n个= 3). *,第页在没有激动剂的情况下,与对照值相比<0.0001。#,第页与使用激动剂时获得的值相比,<0.0001。C类左边,激动剂诱导AGS3-GFP向近核区移位。表达pEGFP::AGS3(25 ng),pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)用载体或U0126(20μ)然后用UK-14304处理细胞10分钟并进行图像分析。赖特AGS3结构的亚细胞分布,其中GPR结构域中的24个丝氨酸/苏氨酸残基突变为丙氨酸(AGS3-PM). 在存在pcDNA3::Gα的情况下,HEK-293细胞表达pEGFP::AGS3-WT(25 ng)或pEGFP::AGS3-PM(25 ngi3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)用激动剂UK-14304治疗10分钟,并进行图像分析。数据表示为平均值±S.E(n个= 3).颗粒物,磷酸突变体。B类C类,的以上数字这个酒吧在里面圆括号表示检查的AGS3-GFP表达细胞的数量。
图7。
图7。
AGS3的TPR结构域对激动剂诱导的AGS3向高尔基体移位的影响。 一个左边,AGS蛋白的示意图。AGS3-Q/A是一种AGS3突变体,在四个GPR基序(GPR1-Q488A、GPR2-Q541A、GPR3-Q589A和GPR4-Q623A)中的每一个基序中都有单残基突变,破坏Gα与单个GPR基序结合。赖特,对AGS3-GFP与GM-130共定位的细胞进行定量分析。表达pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng),pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)和pEGFP::AGS3(25 ng)、pEGFP::AGS3-Q/A(25 ng)10分钟,并按照“实验程序”进行荧光显微镜处理。*,第页在没有激动剂的情况下,与对照值相比<0.0001。B类C类,对AGS3-GFP与GM-130共定位的细胞进行定量分析。表达pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng),pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)和pEGFP::AGS3-WT或AGS3结构(25 ng),单个TPR基序逐渐缺失(B类)或单个TPR基序内保守残基的单一氨基酸突变(C类)与载体或UK-14304(10μ)持续10分钟,并按照“实验程序”GM130的规定进行荧光显微镜处理(红色)免疫荧光检测。B类对800个AGS3-GFP表达细胞进行检测,以确定每个AGS3-GFF构建体的亚细胞分布。数据表示为平均值±S.E(误差线) (n个= 3–5). *,第页与UK-14304处理的对照组相比,<0.0001。对于C类、G50F(TPR1)、G90F(TPR2)、G130F(TPR3)、G270F(TPR 6)。对于一个C类,的以上数字这个酒吧在里面圆括号表示所检查的AGS3-GFP表达细胞的数量。
图8。
图8。
受体激活后内源性AGS3的亚细胞分布。表达pcDNA3::Gα的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或UK-14304(10μ)10分钟后,按照“实验程序”中的描述进行荧光显微镜处理。显示的图像代表了五个以上的单独实验。利用针对编码GPR结构域(Ala)的GST-AGS3融合蛋白产生的亲和纯化抗体检测内源性AGS3461–序列号650)AGS3。GM130通过免疫荧光检测,如“实验程序”所述箭头表明AGS3在受体激活后的近距离定位。通过荧光强度扫描定量内源性AGS3和GM130的相对亚细胞分布(绿色,AGS3-GFP;红色,GM130)通过电池线如“实验程序”所述
图9。
图9。
AGS3易位到高尔基体和分布反式-高尔基蛋白ST-GFP。单独或与pcDNA3::Gα联合表达pEGFP::ST(唾液酸转移酶)(ST-GFP)(50 ng)的HEK-293细胞i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与激动剂UK-14304(10μ)按照“实验程序”中的描述,进行3小时的荧光显微镜处理。显示的图像代表了3-5个单独的实验。B类定量分析显示囊泡数的细胞百分比。数据表示为平均值±S.E(误差线) (n个= 3). *,第页与不存在激动剂的对照值相比,<0.0001。这个以上数字这个酒吧表示检测到的ST-GFP表达细胞的数量。
图10。
图10。
AGS3与载体或α孵育3小时后易位至高尔基体2-肾上腺素能受体激动剂UK-14304。 一个,HEK-293细胞表达pEGFP::AGS3(25 ng)和pcDNA3::Gαi3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750ng)与载体或激动剂UK-14304(10μ)3小时后进行荧光显微镜检查。免疫荧光法检测高尔基体标志蛋白TGN46。对于与激动剂孵育的细胞,显示了三种不同的图像场。B类,HEK-293细胞表达pcDNA3::Gαi3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750 ng)与载体或激动剂UK-14304(10μ)3小时后进行荧光显微镜检查。内源性AGS3(红色)高尔基标志蛋白GM130(绿色)按照“实验程序”中的描述,通过免疫荧光检测图像字段用于与激动剂孵育的细胞。这个下部图像面板由转染pEGFP::AGS3(25 ng)和pcDNA3::Gα的HEK-293细胞并行生成i3类(750 ng)和pcDNA3::α2安培/天-AR(750纳克)。中显示的图像一个B类是三个独立实验的代表。

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