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.2013年6月10日；8（6）：e64953。
doi:10.1371/journal.pone.0064953。 2013年印刷。

Sirt1的药理激活通过调节自噬改善聚谷氨酰胺诱导的毒性

裴贤信 1, 林云基（Yunki Lim）, Hye Jin噢, 桑敏公园, 李成庆（Sun-Kyung Lee）, Joohong Ahnn公司, Do Han Kim先生, 吴根松, 大黄岛, Woo Jin公园
附属公司

Sirt1的药理激活通过调节自噬改善聚谷氨酰胺诱导的毒性

裴贤信等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增亨廷顿蛋白（Htt）的细胞内积累是亨廷顿病（HD）的一个特征。本研究评估了抗癌药物β-拉帕酮（β-lap）激活Sirt1是否诱导人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬，从而降低细胞内polyQ聚集物水平及其伴随的细胞毒性。用β-lap处理细胞可显著降低含有与绿色荧光蛋白（HttEx1（97Q）-GFP）融合的致病性polyQ拉伸物的Htt外显子1的强制表达所诱导的细胞毒性。β-lap增加SH-SY5Y细胞的自噬，LC3-II和自溶体的形成增加证明了这一点。此外，β-lap降低了HttEx1（97Q）-GFP聚集，而与3-甲基腺嘌呤（一种自噬抑制剂）共同孵育可显著阻止HttEx聚集。β-lap增加了Sirt1活性，如Sirt1底物、PARP-1和Atg5的去乙酰化增加以及FOXO1的核移位所示。通过与sirtinol（一种通用的sirtuin抑制剂）共孵育或与抗Sirt1的shRNA共转染，可显著阻止β-lap诱导自噬和减弱HttEx1（97Q）-GFP聚集。在表达Q67与菁荧光蛋白（Q67）融合的转基因秀丽隐杆线虫（C.elegans）中，进一步研究了β-lap的促自噬作用。值得注意的是，β-lap减少了Q67点的数量，并恢复了Q67诱导的运动缺陷，这在很大程度上是通过对sir-2.1，即Sirt1的秀丽线虫直系种进行RNAi预处理来预防的。总的来说，这些数据表明β-lap通过激活Sirt1诱导自噬，这反过来导致polyQ聚集和细胞毒性降低。因此，β-lap为HD的治疗提供了一个新的治疗机会。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：Tae Hwan Kwak是R&D Mazence Inc.的员工，拥有一项专利，保护β-拉帕酮用于治疗代谢性疾病。这并不会改变作者对所有PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。β-lap可防止polyQ介导的细胞毒性。
答：。用pcDNA、pcDNA-HttEx1（25Q）-GFP或（97Q）-GPP质粒转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞。培养24小时后，用不同浓度的β-lap处理细胞12小时。用MTT法测定细胞活力。每个条和误差条代表平均值±SD（n = 3); *第页<0.05, **第页<0.01 vs.无β-lap治疗。B。用pcDNA-HttEx1（25Q）或（97Q）-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。培养24小时后，用DMSO或30 nMβ-lap处理细胞12小时，并暴露于200µM h2O（运行）2再持续5 h。细胞与Hoechst 33342或PI共同染色。PI染色的细胞代表死亡细胞，而Hoechst 33342染色显示所有细胞核。通过测定PI染色细胞与Hoechst染色细胞的比率来计算细胞死亡百分比。每个条和误差条代表平均值±SD（n = 4); **第页<0.01.
图2
图2。β-lap通过诱导自噬减少polyQ聚集。
答：。用pcDNA或pcDNA-HttEx1（97Q）-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。培养24 h后，用不同浓度的β-lap处理细胞12 h。用SDS-PAGE分离细胞裂解物，转移到PVDF膜上，并用LC3或活性caspase-3抗体进行探测。使用GAPDH（用抗GAPDH抗体检测）作为负荷控制。使用NIH ImageJ软件测定蛋白质条带的强度。所示数字表示LC3-II与LC-I的表达比率，或活性caspase-3的表达水平。B。用30 nMβ-lap处理SH-SY5Y细胞7 h，并用400 nM巴非霉素A进一步培养1用SDS-PAGE分离细胞裂解物，转移到PVDF膜上，并用LC3抗体进行检测。使用NIH ImageJ软件测定蛋白质条带的强度。所示数字代表LC3-II与LC-I的表达比率。C、。用mCherry-GFP-LC3质粒转染SH-SY5Y细胞。培养24小时后，用30 nMβ-lap在没有或存在10 mM 3-MA的情况下处理细胞12小时。然后固定细胞并在共焦显微镜下观察。绘制了GFP/mCherry荧光比值。每个条和误差条代表平均值±SD（n = 12); **第页<0.01.D。用pcDNA-HttEx1（25Q）或（97Q）-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。培养24 h后，用DMSO或30 nMβ-lap处理细胞12 h。将细胞裂解物分离为RIPA可溶和RIPA不可溶部分，并用抗GFP（a–d）抗体进行Western blotting分析。（a） 堆积凝胶中截留的PolyQ聚集体用箭头表示，堆积凝胶和分离凝胶之间的边界用虚线表示。（b） 活性caspase-3表达水平的变化证明了β-lap的活性。进行GAPDH（用抗GAPDH抗体（c）检测）和凝胶考马斯蓝染色（d），以确保蛋白质载量相等。（e） 不溶性HttEx1（97Q）蛋白的积累通过过滤延迟试验进行检测。在用抗GFP的抗体进行免疫反应后，使用NIH ImageJ软件测定斑点的强度。显示的数字是光斑强度的任意指标。E.公司。用pcDNA或pcDNA-HttEx1（97Q）-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。与质粒孵育24小时后，在没有或存在30 nMβ-lap和10 mM 3-MA的情况下再孵育36小时。RIPA-不溶性部分的分析如（D）所示。
图3
图3。β-lap通过激活Sirt1来减少polyQ聚集。
答：。用pcDNA或pcDNA-HttEx1（97Q）-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。孵育24小时后，在不含或含有西替诺的情况下用β-lap处理细胞。然后用抗乙酰赖氨酸抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀。沉淀用抗PARP-1或抗Atg5抗体进行Western blot分析。B。用FOXO1-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞，并在不含或含有西地诺的情况下用β-lap处理。然后固定细胞并在共焦显微镜下观察。C、。用pcDNA或pcDNA-HttEx1（97Q）-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。与质粒孵育24小时后，在不存在30 nMβ-lap和50µM sirtinol的情况下再孵育12小时。将细胞裂解物分离为RIPA可溶性和RIPA不溶性部分，并用抗LC3或抗GFP抗体进行Western blotting分析。堆积凝胶中截留的PolyQ聚集体用箭头表示，堆积凝胶和分离凝胶之间的边界用虚线表示。进行GAPDH印迹和考马斯染色以确保蛋白质载量相等。在过滤延迟试验中检测不溶性HttEx1（97Q）蛋白的积累。用抗GFP抗体免疫反应后，使用NIH ImageJ软件测定斑点的强度。显示的数字是光斑强度的任意指标。D。用pcDNA-HttEx1（97Q）转染SH-SY5Y细胞，检测β-lap的polyQ聚集清除能力。用β-lap或β-lap加sirtinol培养后，固定细胞，用Hoechst 33342染色，并在荧光显微镜下观察。绘制了含有GFP标记聚集物的转染细胞的百分比。每个条和误差条代表平均值±SD（n = 4); *第页<0.05, **第页<0.01（学生的t吨-测试）。E.公司。将pcDNA-HttEx1（97Q）-GFP和含有干扰shRNA（SH-Scr）或Sirt1 shRNA（SH-Sirt1）的质粒共同转染SH-SY5Y细胞。与质粒孵育24小时后，在有或无30 nMβ-lap的情况下进一步孵育细胞，并在荧光显微镜下观察。shRNA-harbouring质粒表达迪斯科马sp.红色荧光蛋白（DsRed）；因此，转染该质粒的细胞组成性表达DsRed。绘制了含有GFP标记聚集物的转染细胞的百分比。每个条和误差条代表平均值±SD（n = 8); **第页<0.01（学生的t吨-测试）。
图4
图4。β-lap保护polyQ表达神经元免受毒性秀丽线虫.
A和C。Q19-（a和b）和Q67-表达的荧光显微照片秀丽线虫在存在（b和d）和不存在（a和c）25µMβ-圈的情况下显示（c和d）。所有描绘的动物都是年轻的成年人（孵化后4天）。定量并绘制在琼脂平板（C）上连续运动1分钟期间polyQ点（A）和身体弯曲的平均数量。每个条和误差条代表平均值±SD（A:n = 10、C:n = 31); **第页<0.01（学生的t吨-测试）。B和D。RNA干扰实验使用sir-2.1型Q67中的RNAi；在存在（b和d）或不存在（a和c）25µMβ-lap的情况下进行TU3311双转基因蠕虫。对琼脂平板（D）上连续运动1分钟期间polyQ点（B）和身体弯曲的平均数量进行量化和绘制。每个条和误差条代表平均值±SD（A:n = 10、C:n = 31); **第页<0.01（学生的t吨测试）。
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出版物类型

MeSH术语

赠款和资金

这项工作得到了韩国国家研究基金会（2009-0085747）的资助，韩国政府（MEST）资助的全球研究实验室计划（M6-0605-00-0001）的资助以及光州科学技术研究所（GIST）提供的“系统生物基础设施建设拨款”的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。