XIAP inhibits autophagy via XIAP-Mdm2-p53 signalling

doi:10.1038/emboj.2013.133

.2013年8月14日；32(16):2204-16.

doi:10.1038/emboj.2013.133。 Epub 2013年6月7日。

XIAP通过XIAP-Mdm2-p53信号抑制自噬

Xing Huang（黄兴）¹, 吴正胜（音）, 伊德梅, 吴勉（音）

附属公司

PMID： 23749209
预防性维修识别码：项目经理3746193
内政部： 1038/emboj.2013.133年10月10日

XIAP通过XIAP-Mdm2-p53信号抑制自噬

Xing Huang（黄兴）等。欧洲工商管理硕士J. 2013.

.2013年8月14日；32(16):2204-16.

doi:10.1038/emboj.2013.133。 Epub 2013年6月7日。

作者

Xing Huang（黄兴）¹, 吴正胜（音）, 伊德梅, 吴勉（音）

附属

¹中国科技大学微尺度物理科学国家实验室和生命科学学院，合肥，中国。

PMID： 23749209
预防性维修识别码：项目经理3746193
内政部： 1038/emboj.2013.133年10月10日

摘要

自噬的主要作用是适应饥饿。然而，越来越多的证据表明，自噬抑制在肿瘤发生中也起着重要作用。X-连锁凋亡抑制因子（XIAP）的上调与多种人类癌症相关，但其潜在机制尚不清楚。在这里，我们报道XIAP通过对Mdm2（p53的负调控因子）施加一种先前未确定的泛素E3连接酶活性来抑制自噬。XIAP控制PI3K/Akt途径下游的血清饥饿诱导的自噬。在小鼠模型中，XIAP对自噬的抑制促进HCT116细胞的致瘤性。XIAP介导的自噬抑制也在临床肿瘤样本中得到了大量验证。这些发现揭示了一种新的XIAP-Mdm2-p53通路，该通路介导自噬抑制，XIAP可能通过其促进肿瘤发生。

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提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
XIAP抑制自噬。(A类)具有GFP-LC3稳定表达的HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞中GFP-LC3染色的代表性图像。右侧显示了LC3点状细胞的定量。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差。(B类)用抗LC3抗体免疫印迹法分析HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞中内源性LC3的表达。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S1A所示。(C类)XIAP裂解液^+/+和XIAP^−/−用所示抗体进行western印迹分析小鼠胚胎成纤维细胞。这些数据代表了两个生物复制。(D类)通过电子显微镜观察HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞中的自噬囊泡。这些图像代表了三种生物复制。(E类)如图所示，用Embelin处理HCT116细胞。用抗LC3抗体进行western blot分析，测定LC3-II的积累。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S1B所示。(F类)如图所示，用Embelin处理HCT116 XIAP KO细胞。用抗LC3抗体通过蛋白质印迹分析测定LC3-II的积累。这些数据代表了三个生物复制。(**G公司**)以所示的组合用亮肽和Embelin处理HCT116细胞。通过western印迹分析细胞裂解物。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S1D所示。(**H（H）**)MEF ATG5 WT和ATG5 KO细胞分别转染XIAP特异性或对照siRNA。转染48小时后，用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S1E所示。(我)HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞用20 μM Z-VAD-FMK或DMSO 2 h.然后通过western blotting分析细胞裂解物。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S1F所示。(J型)用Flag-XIAP（D148A/W310A）或对照质粒转染HCT116 XIAP KO细胞。转染后24小时，用所示抗体对细胞裂解物进行western blot分析。这些数据代表了三个生物复制品。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S1G所示。

图2
XIAP通过Mdm2-p53途径抑制自噬。(A类)用XIAP特异性或对照siRNA转染A549和IMR90细胞。用所示抗体对细胞裂解物进行western blot分析。这些数据代表了两个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S2A所示。(B类)用Flag-XIAP或对照载体分别转染表达XIAP特异性或对照siRNA的HCT116细胞、HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞。通过western印迹分析细胞裂解物。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S2D所示。(C类)用Flag-XIAP或对照载体分别转染HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞。进行细胞质/细胞核分离以分析Mdm2和p53的细胞定位。PARP和GAPDH分别用作核（N）和细胞质（C）分数标记。这些数据代表了三个生物复制。(D类)HCT116 p53型^+/+和p53^−/−细胞分别转染XIAP特异性或对照siRNA。通过蛋白质印迹分析检测LC3转化。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S2E所示。(E类)HCT116 p53型^+/+和p53^−/−分别用Flag-XIAP或对照载体转染细胞。western blot分析检测LC3转化。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S2F所示。(F类)HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞经10 μM Nutlin3用于6 h.LC3转化率通过western blot分析进行评估。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S2H所示(**G公司**)HCT116 XIAP KO细胞用指定量的Nutlin处理8 h.用抗LC3抗体进行western印迹分析细胞裂解产物。这些数据代表了三个生物复制。

图3
XIAP是一种用于Mdm2的新型E3连接酶。(A类)用抗XIAP抗体和同种型匹配的对照IgG分别免疫沉淀来自HCT116细胞的裂解物。免疫沉淀和输入用western blotting分析。这些数据代表了两个生物复制。(B类)重组His-XIAP蛋白与纯化的GST和GST-Mdm2融合蛋白在谷胱甘肽珠上分别培养4个 h后用抗-His抗体进行western blot分析。考马斯蓝染色法分析GST和GST-Mdm2。这些数据代表了两个生物复制。(C类)用XIAP特异性或对照siRNA处理HCT116细胞。20小时后，细胞在50 微克毫升⁻¹环己酰亚胺，并随后通过western blotting进行分析。我们应该提到的是，调整了细胞裂解物的数量，以在时间0时达到类似的Mdm2表达水平，而使用相同数量的细胞裂解物来检测XIAP和肌动蛋白的水平。这些数据代表了三个生物复制。Mdm2与肌动蛋白的比值如补充图S3B所示。(D类)第53页^−/−百万平方米^−/−MEF细胞与指定的Mdm2、XIAP和p53构建物共同转染。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。我们应该提到的是，表达XIAP H467A的质粒总是比表达XIAP的质粒使用更少，以确保XIAP和XIAP H467A的表达水平相似。这些数据代表了三个生物复制。(E类)第53页^−/−百万平方米^−/−用所示质粒转染MEF细胞。转染后24小时，用20 μM MG-132用于额外的4个 h.细胞裂解物变性后，与组氨酸结合的蛋白质被镍拉下²⁺-NTA珠子。用抗Mdm2抗体进行western blot分析珠结合蛋白和总细胞裂解物（TCL）。这些数据代表了三个生物复制。(F类)总的来说，2 μM Mdm2或其C464A突变体和1 μM XIAP或其H467A突变蛋白与100 奈米E1，2 μM E2和200 总计20μM Ub 微升*在体外*37°C下的泛素化反应缓冲液 h.用抗Mdm2抗体进行免疫印迹分析反应混合物。这些数据代表了三个生物复制。(**G公司**)第53页^−/−马里兰州2^−/−用所示质粒转染MEF细胞。通过western印迹分析细胞裂解物。这些数据代表了三个生物复制。(**H（H）**)第53页^−/−百万平方米^−/−用所示质粒转染MEF细胞。转染后24小时，用20 μM MG-132用于额外的4个 h.细胞裂解物变性后，与组氨酸结合的蛋白质被镍拉下²⁺-NTA珠子。用抗p53抗体进行western印迹分析珠结合蛋白。这些数据代表了三个生物复制。

图4
XIAP调节血清饥饿诱导的自噬。(A类)用EBSS处理HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞指定的时间段。显微镜下观察GFP-LC3点形成。右侧显示了LC3点状细胞的定量。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差。(B类)EBSS处理HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞4 h后用所示抗体进行western blot分析。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S6B所示。(C类)HCT116 XIAP WT和XIAP KO细胞用1 6μM API-2 h.通过western blotting分析细胞裂解物。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S6C所示。(D类)HCT116细胞经EBSS或不经EBSS处理4次 h.细胞裂解物用抗XIAP抗体进行免疫沉淀，然后进行western blot分析。这些数据代表了两个生物复制。(E类)HCT116细胞的裂解液用抗Mdm2抗体免疫沉淀。用抗p-XIAP抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀物和细胞裂解物。这些数据代表了两个生物复制。(F类)HCT116 XIAP KO细胞转染Flag-XIAP、Flag-JIAP S87A、Flag-XIAP S87D或对照载体。转染后24小时，收集细胞。通过蛋白质印迹分析评估LC3转化率。这些数据代表了三个生物复制。LCII/LC3I与肌动蛋白的比值如补充图S6D所示。(**G公司**)第53页^−/−百万平方米^−/−用HA-Mdm2加Flag-XIAP、Flag-X1AP S87A或Flag-X2AP S87D转染MEF细胞。20小时后，用20 μM MG-132用于另4个 h.用抗HA抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀物用western blotting分析。这些数据代表了两个生物复制。

图5
XIAP调节的自噬与肿瘤发生有关。(A类–C类) 1 × 10⁶HCT116 XIAP重量和1×10⁶XIAP KO细胞（第1组），1×10⁶HCT116 XIAP KO细胞（KO-Ctrl）和1×10⁶稳定表达野生型XIAP（KO-XIAP）的HCT116 XIAP KO细胞（第2组），1×10⁶HCT116 XIAP KO细胞（KO-Ctrl）和1×10⁶HCT116 XIAP KO细胞稳定表达XIAP S87A突变体（KO-XIAP SA）（第3组）或1×10⁶HCT116 XIAP KO细胞（KO-Ctrl）和1×10⁶将稳定表达XIAP S87D突变体（KO-XIAP SD）的HCT116 XIAP KO细胞（第4组）分别注射到裸鼠左侧（左）和右侧（右）。注射五周后，将小鼠处死并拍照(A类). 比较每组6只小鼠切除的所有侧翼肿瘤的体积(n个=6) (B类). 每组6只小鼠的肿瘤重量以平均值±标准差表示(C类). (D类–F类) 1 × 10⁶HCT116 XIAP KO细胞或1×10⁶将稳定表达XIAP D148A/310A的HCT116 XIAP KO细胞注射到裸鼠右侧(n个=3). 注射五周后，将小鼠处死并拍照(D类). 显示了切除肿瘤的体积(E类). 每组三只小鼠的肿瘤重量表示为平均值±标准差(F类). (**G公司**,**H（H）**)将来自食管（G）和结肠（H）的人类肿瘤组织（T）及其相邻正常组织（N）均质以提取蛋白质。蛋白质提取物用所示抗体进行免疫印迹分析。这些数据代表了三个生物复制。印迹(**G公司**,**H（H）**)合格，然后计算LC3II/LC3I与肌动蛋白的比率，如补充图9A和B所示(我)显示了XIAP自噬调节的示意模型。在非应激条件下，磷酸化XIAP与Mdm2相互作用并介导其快速降解，从而维持相对较高的p53水平并抑制自噬的基础水平。为了应对血清饥饿，XIAP由于AKT抑制而进行去磷酸化，从而促进XIAP与Mdm2的分离。这反过来加速了p53的降解，并促进了血清饥饿诱导的自噬。

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中的注释

XIAP：两个世界的抑制剂。
Merlo P、Cecconi F。 Merlo P等人。 EMBO J.2013年8月14日；32(16):2187-8. doi:10.1038/emboj.2013.152。Epub 2013年6月21日。 EMBO J.2013年。 PMID：23792426 免费PMC文章。

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