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.2013年6月5日；33(23):9769-80.
doi:10.1523/JNEUROSSCI.5814-12.2013。

cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化突触结合蛋白-12对海马苔藓纤维LTP至关重要

Yea Jin Kaeser Woo 1, 托马斯·杨茨, 杨晓飞, 彭周, 迪克·吴, 巴勃罗·卡斯蒂略, 托马斯·苏多夫
附属公司

cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化突触结合蛋白-12对海马苔藓纤维LTP至关重要

Yea Jin Kaeser Woo等。 神经科学. .

摘要

突触结合蛋白-12（Syntotagmin-12）是一种丰富的突触小泡蛋白，与其他与突触小囊相关的突触结合素不同，它不结合Ca（2+）。Syt12在丝氨酸-97处被cAMP依赖性蛋白激酶A以活性依赖性方式磷酸化，表明Syt12具有cAMP相关突触可塑性的功能。为了验证这一假设，我们在这里生成了（1）Syt12敲除小鼠和（2）携带单一氨基酸取代[丝氨酸-97-对丙氨酸-（S97A）-取代]的Syt12敲入小鼠。Syt12敲除小鼠和Syt12 S97A-敲除小鼠都能存活和繁殖，在培养的皮层神经元或急性海马脑片中分析，基础突触强度或短期可塑性没有明显变化。然而，Syt12敲除小鼠和Syt12 S97A-敲除小鼠在海马CA3区的cAMP依赖性苔藓纤维长期增强（LTP）中均表现出严重损害。使用不同的实验配置来诱导和监测苔藓纤维LTP，可以观察到这种损伤。此外，尽管Syt12基因敲除对腺苷酸环化酶激活剂forskolin在培养的皮层神经元和海马CA1区诱导的突触传递的短期增强没有影响，Syt12敲除蛋白和Syt12 S97A-敲除蛋白均损害了福斯科林诱导的长期增加的苔藓纤维突触传递。因此，Syt12对于苔藓纤维突触处的cAMP依赖性突触前LTP是必不可少的，并且阻断Syt12的cAMP依赖性磷酸化的单个氨基酸取代足以损害Syt12在苔藓纤维LTP中的功能，表明丝氨酸-97上Syt12的cAMP依赖性磷酸化有助于诱导无苔藓纤维LTP。

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数字

图1。
图1。
Syt12 S97A KI和Syt12 KO小鼠的产生。A类，Syt12 S97A KI和Syt12 KO小鼠的基因靶向策略。在靶向载体中，我们在外显子4（星号）中引入了丝氨酸-97到丙氨酸（S97A）点突变，并在外显子6和7之间的内含子进化非服务区插入了一个新霉素抗性盒（neo），其两侧为frt重组位点。用靶向等位基因产生的小鼠与表达flp重组酶的小鼠杂交，删除新霉素抗性盒，得到Syt12 S97A KI小鼠。利用Syt12 S97A KI小鼠生殖系中的Cre重组获得组成性Syt12 KO小鼠（DT，白喉毒素表达盒；A，用于Southern印迹的AseI限制位点）。BSyt12靶向载体（+/ki）和非结合对照细胞（+/+）同源重组后杂合胚胎干细胞基因组DNA的Southern blot分析。AseI消化后使用5′外部探针（WT带，12.3kb，突变带，3.6kb）。C类Syt12 S97A KI小鼠（左）和Syt12 KO小鼠（右）杂合交配后代的存活率。灰色阴影区域表示预期的孟德尔比率[n个=Syt12 S97A KI分析总共83只小鼠（+/-15只，+/-KI:50只，KI/KI:18只小鼠）n个=120只小鼠，用于Syt12 KO分析（+/+:33，+/KO:58，KO/KO:29）]。
图2。
图2。
Syt12 KI和KO小鼠蛋白质表达特征。A类，使用Syt12抗体对Syt12 S97A KI和Syt12 KO小鼠的全脑匀浆进行免疫印迹分析（顶部印迹；+/+样本中的上带对应于磷酸化的Syt12，下带对应于非磷酸化的Syt12），以及丝氨酸-97上磷酸化的磷酸化的Syt12（*表示非特异性带）。注意S97A KI样本中Syt12的磷酸特异性抗体的Syt12免疫反应性缺失。脂蛋白-α3抗体用作负荷对照。B–E类、同窝WT对照小鼠和Syt12 S97A KI脑蛋白水平的定量免疫印迹分析(B和C类)或Syt12 KO(D类和E类).B和D类描述由PhosphorImager可视化的代表性斑点；C类和E类，使用量化蛋白质水平125I标记二级抗体(n个=3个独立实验）。Cpx1/2，复合蛋白1/2；ELKS1/2，Rab6相互作用蛋白；拉夫、拉菲林；Syn，突触蛋白；Syb2，Synaptobrevin-2；Synt1，Syntaxin-1）。统计差异由Student’st吨测试(*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001).
图3。
图3。
在同窝WT和Syt12-KO小鼠培养的皮层神经元中，Syt12不是自发或诱发神经递质释放所必需的。A类,BmEPSC频率和振幅（底部）的代表记录道（顶部）和总结图(A类)和或mIPSC(B)有或没有forskolin处理（50μ米持续1小时）。C类,D类，代表性痕迹(C类)和振幅总结图(D类)由单个测试脉冲诱发的EPSC和IPSC的数量。E类，10Hz刺激序列持续1s诱发IPSC的代表性痕迹。F类，10 Hz刺激序列期间IPSC振幅的绘图，标准化为第一个峰值振幅，并根据刺激数绘制。数据为平均值±SEM；分析的细胞/独立培养物数量显示在条形图中。统计评估由Student’st吨测试(*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图4。
图4。
重新评估野生型和S97A突变型Syt12过度表达对培养皮层神经元自发微释放的影响。A类,BmEPSC频率和振幅的代表性轨迹（左）和总结图（右）(A类)和mIPSC(B)作为forskolin（50μ米). 感染对照慢病毒和过表达野生型Syt12慢病毒的神经元（Syt12重量)或S97A-突变型Syt12（Syt12S97A系列)进行了分析。所示数据为平均值±SEM；分析的细胞/独立培养物数量显示在条形图中。统计评估由Student’st吨测试(*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001).
图5。
图5。
WT、Syt12 S97A KI和Syt12 KO小鼠海马CA1区急性切片中兴奋性和抑制性突触传递的特征。A类，使用同窝WT和Syt12 S97A KI小鼠切片中的细胞外场电位记录检查兴奋性突触的输入/输出关系。代表性记录道，在一个切片中多次扫描的平均值，显示在测试刺激强度的顶部（5、10、20、40和60 V）。电压响应的快速部分是纤维束（FV），其余部分是突触电位（fEPSP）。在强烈刺激强度下观察到的阳性反应是群体峰值。场内EPSP斜率与光纤截击幅度的总图如下所示。B，通过对WT和Syt12 S97A KI小鼠切片中配对脉冲比率（PPR）的现场记录测量来评估兴奋性突触的短期可塑性。顶部显示了20、50、200、400和800 ms刺激间隔（ISI）配对脉冲的代表性轨迹，响应的快速和慢速分量分别对应于光纤截击和fEPSP，数据的汇总图如下所示。C类,D类，与相同A类和B，但对同窝WT和Syt12 KO小鼠进行了分析。E类，通过全细胞记录评估同窝出生的WT和Syt12 S97A KI小鼠切片中抑制性突触的输入/输出关系。顶部显示了一个切片中多次扫描的平均代表记录道，IPSC振幅与刺激强度的汇总图如下所示。F类，与相同B但PPR是通过抑制性突触的全细胞记录来测量的。G公司,H（H），与相同E类和F类，但对WT和Syt12 KO小鼠的切片进行了分析。所示数据为平均值±SEM。括号中显示了测试的切片/小鼠数量。使用Student’st吨测试(第页>0.05）。
图6。
图6。
WT和Syt12 S97A KI小鼠海马CA3区急性切片中苔藓纤维突触兴奋性突触传递的特征（所有数据均表示NMDA受体介导的EPSCs的全细胞记录）。A类，突触前25 Hz刺激脉冲触发高频易化。代表性记录道显示在顶部，EPSC振幅汇总图显示在底部（减去每个新脉冲之前达到的基线电流后，归一化为脉冲群中的第一个脉冲）。B，通过将基线刺激频率从0.05 Hz改变为0.5 Hz而诱导的低频促进。轨迹（上图）取自一个具有代表性的实验，其时间点与总结图（下图）中所示的数字相匹配。C类，PPR的测量。从同窝WT和S97A KI小鼠的切片中获得了随着刺激间隔增加而诱发的两个连续EPSCs的代表性痕迹（顶部）和产生的配对脉冲比率的总结图（底部）。测试了20、40、200、500和1000 ms的刺激间隔。数据为平均值±SEM。括号中显示了测试的切片/小鼠数量。使用Student’st吨测试(第页>0.05）。
图7。
图7。
通过细胞外场记录监测，Syt12 S97A KI和Syt12 KO损害mfLTP。A类，在诱导同窝WT和Syt12 S97A KI小鼠急性切片中的mfLTP之前（痕迹1）和之后（痕迹2），苔藓纤维场-EPSP（fEPSPs）的代表性痕迹。mfLTP由两个相隔20s的25Hz/5s刺激序列诱导产生，并在NMDA受体拮抗剂存在下应用d日-APV（50μ米)诱导后立即被冲走。在每次单独的mfLTP实验后，将切片暴露于1μ米DCG-IV是II组mGluR激动剂，用于确定苔藓纤维突触输入对fEPSP的相对贡献（灰色痕迹）。B，苔藓纤维fEPSP振幅的总结数据绘制为mfLTP诱导前后时间的函数（箭头）。阴影框表示切片暴露于d日-APV。为清楚起见，从汇总图中删除了DCG-IV区块数据。数字表示中所示记录道的时间点A类.C类，每个基因型中观察到的LTP大小的分布，用圆圈表示单个实验中观察到值（WT，基线的187.6±8.4%；S97A KI，基线143.2±8.5%；第页<0.003（按学生）t吨测试）。D–F型，与相同A–C，但在Syt12 WT和KO同窝小鼠中检测了mfLTP。圆圈在F类表示单个实验中观察到的值（WT 202.0±10.7%基线；KO 145.6±11.3%基线；第页<0.005（按学生）t吨测试）。所示数据为平均值±SEM。括号中显示了测试的切片/小鼠数量。中的水平括号B和E类指示测量LTP大小的时间窗口。鉴于在细胞外记录中观察到大量PTP，刺激序列后的前三个点被数字删除，以便于LTP的可视化。这些点在各组之间没有差异。
图8。
图8。
通过全细胞记录监测，Syt12 S97A KI损害mfLTP。A类，在诱导mfLTP之前（迹线1）和之后（迹线2）NMDA受体EPSC的代表性平均迹线。mfLTP由两个相隔20 s的25 Hz/5 s刺激序列诱导产生。在每次单独的mfLTP实验后，将切片暴露于1μ米DCG-IV是II组mGluR激动剂，用于确定苔藓纤维突触输入对记录的EPSC的相对贡献（灰色痕迹）。B，苔藓纤维NMDA受体EPSC振幅的总结数据，绘制为mfLTP诱导前后的时间函数（箭头）。为清楚起见，从汇总图中删除了DCG-IV区块数据。数字表示中所示记录道的时间点A类水平括号表示测量LTP大小的时间窗口。C类各基因型mfLTP幅度的分布（WT 221.7±19.7%基线；S97A 159.9±13.4%基线；第页= 0.016). 圆圈表示单个实验中观察到的值。D类mfLTP诱导前后WT和S97A KI神经元以40 ms的刺激间隔测量配对脉冲比率；注意到WT显著降低，但KI神经元没有显著降低（WT:LTP前3.5±0.2；LTP后2.6±0.2；第页= 0.039; S97A：LTP前3.6±0.2；LTP后3.3±0.2；第页> 0.05). 数据为平均值±SEM。括号中显示了测试的切片/小鼠数量。
图9。
图9。
使用全细胞记录检测Syt12 WT、S97A和KO小鼠中Forskolin诱导的苔藓纤维突触传递增强。A类、同窝WT和Syt12 S97A KI小鼠海马CA3区锥体神经元记录的NMDA受体介导的EPSCs的代表性迹线（顶部）和总结图（底部）。总结图描述了归一化EPSC振幅作为添加10μ前后时间的函数米如灰色条所示应用的forskolin。数字表示上述记录道的时间点。DCG-IV（1μ米)在每个单独实验结束时进行沐浴，以确定苔藓纤维对突触传递的贡献。为清楚起见，从汇总图中删除了DCG-IV区块数据。forskolin诱导的长期增强幅度在各组之间存在显著差异（WT 251.8±37.5%基线；S97A 152.9±20.8%基线；第页=0.040），而短期强化（5分钟至15分钟）没有（WT 325±45%基线；S97A 270±37%基线；第页= 0.356).B，与相同A类但切片来自同窝Syt12 KO和WT小鼠（forskolin诱导的长期增强：WT 207.8±33.8%基线；KO 104.2±12.7%基线；第页=0.027；短期增强为基线的353±48%；KO 260±53%基线；第页= 0.153). 数据绘制为平均值±SEM。括号中显示了测试的切片/小鼠数量。底部面板中的水平括号表示测量forskolin诱导增强幅度的时间窗口。
图10。
图10。
WT和Syt12 KO小鼠海马CA1区的抑制性突触强度无PKA依赖性变化。A类，对抑制性自发mIPSC的测量表明，从同窝小鼠获得的WT和Syt12 KO神经元的mIPSC频率或振幅没有差异。代表性记录道显示在顶部，mIPSC频率（左）和振幅（右）的累积概率图显示在底部。B，腺苷酸环化酶激活剂forskolin（20μ米)在WT和Syt12 KO海马中产生类似的mIPSC频率增强。代表性记录道显示在顶部，规范化mIPSC频率随时间变化的曲线图显示在底部。C类iLTD在WT和Syt12 KO神经元中也有类似的诱导作用。代表性记录道显示在顶部，归一化IPSC振幅汇总图显示在底部。代表记录道中的数字对应于摘要中所示的时间。如箭头所示，iLTD在时间0使用TBS触发。D类Forskolin（20μ米)WT和Syt12 KO海马中诱发的IPSC出现类似的急性增强。代表性记录道显示在顶部，归一化IPSC振幅随时间变化的总结图显示在底部。数据绘制为平均值±SEM。括号中显示了测试的切片/小鼠数量。在这里分析的任何参数中，未发现WT和Syt12 KO小鼠之间存在统计上的显著差异。
图11。
图11。
突触前mfLTP诱导相关分子通路的图解。在苔藓纤维的重复激活过程中，Ca2+在突触前神经末梢活性区直接区域外积聚，从而通过钙调素激活腺苷酸环化酶（AC）。腺苷酸环化酶的激活增加了突触前cAMP的水平，进而激活磷酸化Syt12和可能的其他靶标的蛋白激酶-A。然后，这些靶点与RIM1α和Rab3A合作，提高神经递质释放机制的功效，从而产生神经递质长期释放增强。
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