Arabidopsis μ-adaptin subunit AP1M of adaptor protein complex 1 mediates late secretory and vacuolar traffic and is required for growth

doi:10.1073/pnas.1300460110

.2013年6月18日；110(25):10318-23.

doi:10.1073/pnas.1300460110。 Epub 2013年6月3日。

适配体蛋白复合物1的拟南芥μ-适配体亚基AP1M介导晚期分泌和空泡运输，是生长所必需的

米松公园¹, Kyungyoung Song（宋庆英）, 伊尔卡·赖夏特, 海兰·金, 乌尔里克·迈耶, 约克-迪特尔·斯蒂尔霍夫, 黄仁文, Gerd Jürgens

附属公司

PMID： 23733933
预防性维修识别码： PMC3690844型
内政部： 10.1073/pnas.1300460110

适配体蛋白复合物1的拟南芥μ-适配体亚基AP1M介导晚期分泌和空泡运输，是生长所必需的

米松公园等。美国国家科学院程序. 2013.

.2013年6月18日；110(25):10318-23.

doi:10.1073/pnas.1300460110。 Epub 2013年6月3日。

作者

米松公园¹, Kyungyoung Song（宋庆英）, 伊尔卡·赖夏特, 海兰·金, 乌尔里克·梅耶尔, 约克·迪特尔·斯蒂尔霍夫, 黄仁文, Gerd Jürgens

附属

¹Entwicklungsgenetik and Microscopy，Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen（ZMBP），德国图宾根大学，邮编：72076。

PMID： 23733933
预防性维修识别码： PMC3690844型
内政部： 10.1073/pnas.1300460110

摘要

衔接蛋白（AP）复合物是哺乳动物细胞高尔基后运输过程中膜泡的主要外壳蛋白。每个AP复合物包含一个特定的介质亚单位μ-adaptin，它选择带有序列特异性排序基序的货物蛋白。关于植物中AP复合体及其μ亚基的了解较少。由于不确定的同源性，拟南芥的μ-适应蛋白已被命名为muA至muD[Happel等人（2004）Plant J37（5）:678-693]。此外，只有muD被分配给参与Golgi-vacuolar贩运的特定AP复合体AP-3[Niihama等人（2009）Plant Cell Physiol 50（12）：2057-2068，Zwiewka等人（2011）Cell Res 21（12）:1711-1722，以及Wolfenstetter等人（2012）Plant Cell 24（1）：215-232]。相反，高尔基后贩运AP-1复合物和内吞AP-2复合物的μ亚单位均未被鉴定。在这里，我们报告了冗余AP-1μ-适配蛋白AP1M1（也称为muB1）和AP1M2（也称为muB2）的功能分析。免疫共沉淀显示，AP1M2及其表达较弱的亚型AP1M1均与AP-1的大亚基γ-适应性蛋白复合。此外，AP1M2定位于转高尔基网络或其附近。AP1M2.敲除突变损害花粉功能并阻碍植物生长，而ap1m1 AP1M2双突变体几乎是花粉致死。在细胞水平上，AP1M2的缺失意味着抑制了从跨高尔基体网络到间期液泡和质膜以及到胞质分裂平面的多种运输途径。因此，AP-1在植物细胞高尔基后贩运中至关重要，是细胞分裂和植物生长所必需的。

关键词：适配器复合体1；发展；膜交通；分泌途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
T-DNA插入*AP1平方米*突变体，*ap1月2-1日*和*发生在13日*，显示生长延缓表型。(A类)T-DNA插入示意图：*ap1月2-1日*（FLAG_293C11），第六外显子，生态型Ws；*图1m2-2*（SALK_090944），启动子；*发生在13日*，第八外显子，生态型*哥伦比亚*（列）。(B类)用中所示引物进行RT-PCR分析A类检测*AP1平方米*和*AP1M1系列*成绩单*ap1月2-1日*,*发生在13日*和T-DNA插入*AP1M1系列*突变体（另见图S4).18S rRNA(*18秒*)用作加载控制。Kb，千基。(C类和D类)的表型*ap1平方米*突变体。(C类)幼苗根系生长受阻*ap1平方米*突变体。这种突变表型通过表达*AP1M2:：AP1M2:3×HA*T，转基因。(D类)WT和*ap1平方米*FM4-64染色的突变体。注意不规则和肿胀的根细胞*ap1月2-1日*和*发生在13日*. (E类)自受精F1代后代*ap1m1/ap1m1 ap1m2-1/ap1m2*（另请参见表S1和S2系列用于遗传分析）。箭头表示未受精的胚珠。[比例尺：1厘米(C类); 5微米(D类); 1毫米(E类).]

**图2。**
内标记AP1M2在TGN处或附近的亚细胞定位。(A类和B类)表达AP1M2:：AP1M2:3×HA的幼苗根部的共聚焦图像*ap1月2-1日*抗γCOP（高尔基）复染纯合背景(A类)和抗SYP61抗血清（TGN）(B类). 使用线性皮尔逊相关系数量化共定位程度(第页_第页)和非线性Spearman秩相关系数(第页_秒); 生成的散点图图像显示在右侧。值1.0表示两个荧光信号完全同位。请注意，与γCOP标记的高尔基体堆栈相比，AP1M2:3×HA优先与TGN标记的抗SYP6内体共定位。另请参见图S5A类–D类进行进一步的本地化分析。蓝色，DAPI染色质。插图以更高的放大率显示方框区域。（比例尺：5μm）

**图3。**
AP1M2和AP1M1与内源性γ-适应性蛋白相互作用。(A类)AP1M2与γ-adaptin的相互作用。蛋白质提取物*ap1月2-1日*将表达CsVMV:：AP1M2:myc的纯合植物用抗T7或抗myc抗体进行免疫沉淀（IP），并用抗α-适应蛋白或抗γ-适应蛋白抗血清进行免疫印迹分析。使用抗-T7珠作为非特异性免疫沉淀的对照。(B类)AP1M1与γ-adaptin的相互作用。原生质体转化蛋白提取物*35S:：AP1M1:3×myc*用抗myc抗体进行免疫沉淀，并使用抗myc、抗α-适应蛋白或抗γ-适应蛋白抗血清进行免疫印迹分析。IN，输入（总提取）；非转化原生质体。开放三角形，α-adaptin；星号，γ-adaptin；箭头，AP1M1:3×myc。

**图4。**
分泌和空泡通路受损*ap1月2-1日*.液泡的瞬时运输分析(A类)或分泌型(B类)货物蛋白质。从非转化（Non）、，*ap1月2-1日*和两个独立获救的电厂(*CsVMV:：AP1M2:myc*在里面*ap1月2-1日*)被转化为*AALP:GFP公司*或*β-果糖苷酶4:GFP（β-Fruc4:GFP）*在转化后24小时，用抗GFP抗体对原生质体总蛋白提取物进行免疫印迹分析。Asterisk，全长AALP:GFP；双闭合三角形，AALP处理条带：GFP；双星，全长AtβFruc4:GFP；闭合三角形，处理AtβFruc4:GFP带。(B类)转化酶：GFP（Inv:GFP）转化为从指定植物制备的原生质体。在转化后24小时，用抗GFP抗体对原生质体（C）和培养基（M）中提取的总蛋白进行免疫印迹分析。ER-localized binding protein（BiP）被用作细胞蛋白非特异性泄漏的对照。

**图5。**
超结构分析*ap1平方米*突变体。冻固和冻代根尖超薄切片*ap1月2-1日*和*发生在13日*用透射电子显微镜检查幼苗。*ap1平方米*突变体展示了弯曲的高尔基堆积物(A类和B类)（与WT相比(C类)]和细胞壁残端/不完整细胞壁（箭头）(D类和E类). 还请注意，在*ap1月2-1日*突变体(D类). CW，细胞壁；G、高尔基堆积；M、线粒体；N、细胞核；T处，反式-高尔基网络；五、液泡。[比例尺：500 nm(A类–C类); 6微米(D类); 3微米(E类).]

**图6。**
年受损KN贩运至细胞分裂平面*平均1平方米*突变体。WT和*ap1平方米*纯合突变苗(*ap1月2-1日*和*发生在13日*)用抗KN（绿色）和抗管蛋白（红色）抗血清进行固定和免疫染色。请注意，KN不向由膜微管标记的细胞分裂平面运输*ap1平方米*突变体，与WT.蓝色DAPI染色质形成对比。（比例尺：5μm）

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1. Glyvuk N等。AP-1/sigma1B-适应素介导内胚突触小泡循环、学习和记忆。EMBO J.2010；29(8):1318–1330.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Stepp JD、Pellicena-Palle A、Hamilton S、Kirchhausen T、Lemmon SK。酿酒酵母Apm1p的晚期高尔基体分选功能，但不适用于Apm2p，后者是第二种酵母网格蛋白AP介质链相关蛋白。分子生物学细胞。1995;6（1）：41–58。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Klumperman J、Kuliawat R、Griffith JM、Geuze HJ、Arvan P.甘露糖6-磷酸受体是通过衔接蛋白AP-1、网格蛋白和突触蛋白6-阳性小泡从未成熟分泌颗粒中分离出来的。细胞生物学杂志。1998;141(2):359–371.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Dwyer ND、Adler CE、Crump JG、L'Etoil ND、Bargmann CI。极化树突转运和AP-1 mu1网格蛋白适配器UNC-101将气味受体定位于嗅纤毛。神经元。2001年；31(2):277–287.-公共医学

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[3] Glyvuk N等。AP-1/sigma1B-适应素介导内胚突触小泡循环、学习和记忆。EMBO J.2010；29(8):1318–1330.-项目管理咨询公司-公共医学

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[6] Stepp JD、Pellicena-Palle A、Hamilton S、Kirchhausen T、Lemmon SK。酿酒酵母Apm1p的晚期高尔基体分选功能，但不适用于Apm2p，后者是第二种酵母网格蛋白AP介质链相关蛋白。分子生物学细胞。1995;6（1）：41–58。-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Klumperman J、Kuliawat R、Griffith JM、Geuze HJ、Arvan P.甘露糖6-磷酸受体是通过衔接蛋白AP-1、网格蛋白和突触蛋白6-阳性小泡从未成熟分泌颗粒中分离出来的。细胞生物学杂志。1998;141(2):359–371.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Klumperman J、Kuliawat R、Griffith JM、Geuze HJ、Arvan P.甘露糖6-磷酸受体是通过衔接蛋白AP-1、网格蛋白和突触蛋白6-阳性小泡从未成熟分泌颗粒中分离出来的。细胞生物学杂志。1998;141(2):359–371.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Dwyer ND、Adler CE、Crump JG、L'Etoil ND、Bargmann CI。极化树突转运和AP-1 mu1网格蛋白适配器UNC-101将气味受体定位于嗅纤毛。神经元。2001年；31(2):277–287.-公共医学

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